Unraveling the interaction of Streptococcus pneumoniae with human vitronectin

Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a harmless resident of the human nasopharyngeal cavity, and, in general, every individual is likely to be colonized asymptomatically at least once during life. However, under certain conditions, the bacterium can spread to other tissues and organs causing local, non-invasive infections but also lifethreatening, invasive diseases. Pneumococcal carriage and infection is a highly regulated interplay between pathogen- and host-specific factors and the intimate contact of S. pneumoniae with the surface of the nasopharynx is the crucial step in pneumococcal pathogenesis. Pneumococcal adherence to the respiratory epithelium is mediated by surface-exposed adhesins. These adhesins engage host cell receptors either directly or indirectly by recognizing glycoproteins of the extracellular matrix (ECM) including structural components, such as collagens, laminins, and fibronectins, as well as plasma-derived ECM modulators, like vitronectin and Factor H. Pneumococcal surface protein C (PspC) is a surface-exposed protein and important virulence factor of S. pneumoniae. The multifunctional PspC protein promotes pneumococcal adherence to host cells by interacting with the secretory component of the human polymeric Immunoglobulin receptor of respiratory cells. In addition, PspC facilitates pneumococcal immune evasion by recruiting the complement inhibitor proteins C4b-binding protein (C4BP) and Factor H. Moreover, Factor H bound to the pneumococcal surface promotes bacterial adhesion to human epithelial and endothelial cells. S. pneumoniae also interacts with the human glycoprotein vitronectin. In plasma, monomeric vitronectin regulates thrombosis, fibrinolysis and the terminal complement cascade, while it additionally mediates cell-matrix interactions, cell adhesion and migration in the ECM. It was shown that multimeric, ECM-associated vitronectin facilitates pneumococcal adherence to respiratory epithelial cells. In addition, the interaction of pneumococci with vitronectin promotes their uptake by mucosal epithelial cells via the engagement of the integrin αvβ3 receptor and activation of intracellular signaling pathways culminating in cytoskeletal rearrangements. This study aims to identify and characterize the surface-exposed protein(s) that mediate binding of pneumococci to vitronectin and to elucidate the impact of vitronectin on pneumococcal pathogenesis beyond its function as molecular bridge between pneumococcus and host. Flow cytometric, immunosorbent and surface plasmon resonance experiments revealed that PspC is a vitronectin-binding protein of S. pneumoniae. The specificity of the interaction with vitronectin was confirmed using recombinant PspC proteins and Lactococcus lactis heterologously expressing PspC on their surface. Factor H did not hinder vitronectinbinding to PspC indicating that vitronectin recognizes the central part of PspC. Secretory IgA inhibited but not completely prevented vitronectin-binding to PspC, strongly suggesting that vitronectin binds near, but not directly to, the SC-binding region within the R domain(s) of PspC. In addition, PspC proteins comprising two R domains bound with higher affinity to vitronectin than PspC containing only one R domain, indicating that two interconnected R domains are required for efficient vitronectin-binding. Despite the sequential and structural differences to classical PspC, the PspC-like protein Hic specifically interacted with vitronectin with similar affinity than PspC containing two linked R domains. Binding studies confirmed that Factor H interacts with the very N-terminal region of Hic showing high sequence homology to classical PspC proteins, while vitronectin recognizes an adjacent region in the N-terminal region of Hic. The studied PspC proteins bound to both soluble and immobilized vitronectin, and the C-terminal heparin-binding domain (HBD3) was identified as PspC-binding motif in soluble vitronectin. However, in its immobilized form, vitronectin likely exposes additional binding sites for PspC since a region N-terminally to the identified HBD3 conferred binding of PspC. Vitronectin inhibits the terminal complement pathway, thereby preventing proinflammatory immune reactions and tissue damage. In general, pneumococci are protected from opsonization and MAC-dependent lysis by their capsule. However, pneumococci in close contact to human cells can become susceptible to complement attack due to reduced amounts of capsule. In addition, they can be severely affected by TCC-induced inflammatory responses. Vitronectin bound to PspC significantly inhibited the formation of terminal complement complexes. Thus, the interaction of PspC with vitronectin might aid in immune evasion of S. pneumoniae by inhibiting complement-mediated lysis and/or suppressing proinflammatory events. In conclusion, the results revealed the multifunctional PspC and Hic as vitronectin-binding proteins and proposed a novel role for the specific interaction of S. pneumoniae with vitronectin in regulating the complement cascade, beside its function as molecular bridge to the respiratory epithelium.Der Nasenrachenraum ist bei 40-70% der Menschen asymptomatisch mit Streptococcus pneumoniae (der Pneumokokkus) besiedelt. Unter bestimmten Umständen jedoch können sich Pneumokokken in andere Gewebe und Organe ausbreiten und entweder lokale, nicht-invasive Entzündungen oder auch lebensgefährliche, invasive Erkrankungen hervorrufen. Die Kolonisierung und Infektion mit Pneumokokken beruht auf einem komplexen Zusammenspiel zwischen bakteriellen Virulenzfaktoren und humanen Wirtsfaktoren. Der enge Kontakt der Pneumokokken mit Wirtszellrezeptoren auf der Oberfläche der respiratorischen Epithelzellen wird durch oberflächenassoziierte Pneumokokkenproteine (Adhäsine) entweder direkt oder über Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) ermöglicht. Die Adhäsine der Pneumokokken erkennen sowohl strukturgebende EZM-Proteine wie Kollagene, Laminine und Fibronektine als auch Plasmaproteine wie Vitronektin und Faktor H, die in den Geweben Zell-Matrix-Interaktionen und Zellfunktionen regulieren. Das Oberflächenprotein PspC (pneumococcal surface protein C) ist ein oberflächenlokalisiertes Protein und einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von S. pneumoniae. Als Adhäsin bindet PspC über ein in der R-Domäne lokalisiertes konserviertes Hexapeptidmotiv an die extrazelluläre Domäne, der sekretorischen Komponente, des humanen polymeren Immunglobulinrezeptors und vermittelt so die Anheftung von Pneumokokken an respiratorische Epithelzellen. PspC rekrutiert über dieses Motiv auch lösliche und an mukosales IgA (sIgA) gebundene sekretorische Komponente. Weiterhin interagiert PspC mit den regulatorischen Komplementproteinen C4b-Bindeprotein (C4BP) und Faktor H, um die Aktivierung des Komplementsystems auf der Pneumokokkenoberfläche zu unterbinden und so vor der Komplement-vermittelten Opsonophagozytose zu schützen. Darüber hinaus fördert oberflächengebundenes Faktor H als Brückenmolekül die Adhäsion von Pneumokokken an humane Wirtszellen. Pneumokokken können ebenfalls mit dem humanen Glykoprotein Vitronektin interagieren. Das im Plasma vorhandene Vitronektin reguliert wichtige physiologische Prozesse, wie die Thrombose, Fibrinolyse und die terminale Komplementkaskade. In der EZM vermittelt Vitronektin zusätzlich Zell-Matrix-Interaktionen, die Zelladhäsion und Zellmigration. Obwohl Pneumokokken auch lösliches Vitronektin an ihre Oberfläche rekrutieren, ermöglicht nur zell-gebundenes Vitronektin die Anheftung der Pneumokokken an respiratorische Epithelzellen. Dabei vermittelt das Vitronektin auch eine Internalisierung des Pathogens über den humanen αvβ3-Integrinrezeptor. In dieser Arbeit sollten oberflächenassoziierte Pneumokokkenproteine identifiziert und charakterisiert werden, die mit humanem Vitronektin interagieren. Außerdem wurde untersucht, ob Vitronektin eine weitere besondere Rolle, neben der Funktion als Brückenmolekül, in der Pathogenität von Pneumokokken spielt. In der Durchflusszytometrie sowie in Immunadsorptions- und Oberflächenresonanzexperimenten konnte gezeigt werden, dass das multifunktionale Oberflächenprotein PspC ein Vitronektin-bindendes Protein von S. pneumoniae ist. Die Spezifität der Interaktion von PspC mit Vitronektin wurde mit rekombinanten PspC-Peptiden und heterologen, PspCexprimierenden Lactococcus lactis Bakterien bestätigt. Faktor H konnte die Bindung von Vitronektin an PspC nicht inhibieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Vitronektin zentral im N-terminalen Bereich, voraussichtlich in der R-Domäne, von PspC bindet. Sekretorisches IgA, an welches die sekretorische Komponente kovalent gebunden ist, reduzierte zwar die Bindung von Vitronektin an PspC, konnte sie aber nicht vollständig unterbinden. Daher wurde vermutet, dass die Bindungsstellen für Vitronektin und die sekretorische Komponente in enger Nachbarschaft in der R-Domäne des PspC-Proteins lokalisiert sind. PspC-Proteine, die zwei R-Domänen besitzen, binden Vitronektin mit einer deutlich höheren Affinität als PspC mit nur einer R-Domäne. Es liegt daher nahe, dass zwei miteinander verbundene R-Domänen für eine effiziente Bindung von Vitronektin erforderlich sind. Trotz der großen Unterschiede in Sequenz und Struktur zu den klassischen PspCProteinen, konnte auch für das PspC-ähnliche Hic Protein eine spezifische Interaktion mit Vitronektin nachgewiesen werden. Hic wird über eine Sortase kovalent im bakteriellen Peptidoglykan verankert, während klassische PspC-Proteine über die C-terminalen Cholinbindenden Repeats mit dem Phosphorylcholin der Zellwand assoziiert sind. Hic bindet Vitronektin mit ähnlicher Affinität wie klassisches PspC mit zwei R-Domänen. Bindungsstudien mit rekombinanten Hic-Peptiden bestätigten, dass Faktor H mit dem vorderen N-terminalen Bereich von Hic interagiert, während die Bindungsstelle für Vitronektin benachbart im N-terminalen Bereich des Hic-Proteins lokalisiert ist. Die untersuchten PspC-Proteine haben sowohl lösliches als auch immobilisiertes Vitronektin gebunden und in Bindungsstudien konnte die C-terminale Heparinbindedomäne (HBD3) als PspC-Erkennungsstelle in löslichem Vitronektin identifiziert werden. Weiterhin konnte für das immobilisierte Vitronektin eine Region N-terminal zur HBD3 als weitere Bindungsstelle für PspC identifiziert werden. Vitronektin inhibiert die Bildung und Aktivierung des terminalen Komplementkomplexes (TCC) und verhindert so Zell- und Gewebeschäden. Pneumokokken sind in der Regel aufgrund ihrer Kapsel gegen Opsonisierung und Lyse durch den Membranangriffskomplex geschützt. Allerdings zeigen Pneumokokken, die in engem Kontakt mit Wirtszellen stehen, eine verminderte Kapseldicke und können daher empfindlich gegenüber dem Komplement und der Phagozytose durch professionelle Phagozyten werden. Außerdem können sie durch TCC-induzierte proinflammatorische Immunantworten beeinträchtigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass an PspC-gebundenes Vitronektin effektiv die terminale Komplementkaskade hemmt. Die Interaktion von PspC mit Vitronektin fördert so womöglich die Immunevasion von S. pneumoniae, in dem eine Komplementvermittelte Lyse verhindert und proinflammatorische Immunantworten unterdrückt werden. Zusammenfassend konnten PspC und Hic als Vitronektin-bindende Oberflächenproteine von S. pneumoniae identifiziert und charakterisiert werden. Die vorliegenden Ergebnisse deuten außerdem darauf hin, dass Vitronektin neben seiner Rolle als Brückenmolekül für die bakterielle Adhäsion an humane Wirtszellen auch eine wichtige Funktion bei der Immunevasion von Pneumokokken spielt