Investigations to iron limitation in Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae is one of the leading human pathogen causing morbidity and mortality worldwide. The pneumococcus can cause a variety of different diseases ranging from mild illnesses like otitis media and sinusitis to life-threatening diseases such as pneumonia, meningitis and sepsis. Mostly affected are infants, elderly and immune-suppressed patients. Although, there are vaccines against pneumococci available, still hundreds of thousands of people got infected each year. These vaccines are targeting the pneumococcal polysaccharide capsule. Because of the high number of different serotypes, it is not possible to generate a vaccine against all present serotypes. In the last years a shift to non-vaccine serotypes was noticed. This strengthens the need for the development of vaccines which do not target polysaccharides. Thus, proteins came into focus as potential new vaccine candidates or targets for drug treatment, because several proteins are highly conserved among different strains or even genera. Proteome analyses can give insights into the protein composition in a certain state of a bacterium. So, targets can be identified, which are especially expressed under infection-relevant conditions. Iron limitation is one of these conditions and the knowledge on iron acquisition in pneumococci is still limited. Iron is an essential trace element and as redox-active catalyst or as cofactor involved in various key metabolic pathway in nearly all living organisms and thus also in bacteria. For instance, iron is necessary during biosynthesis of amino acids and in electron transport as well as in DNA replication. Within the human host iron is extremely limited due to its high insolubility under physiological conditions, which is part of the nutritional immunity of its human host. Hence, bacteria had to evolve mechanism to overcome iron starvation. In this thesis the adaptation process triggered by iron limitation in the S. pneumoniae serotype 2 strain D39 was investigated in a global mass spectrometry-based proteome analysis. In preceding growth experiments the pneumococcal growth was adapted to the needs of proteomic workflows. In order to investigate the pneumococcal response to iron limitation, the organic iron-chelating agent 2,2’-bipyridine (BIP) was applied. For the quantification of changes in protein abundances comparing stress to control conditions the very reliable and robust metabolic labeling technique Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) was used. This method requires the bacterial cultivation in a chemically defined medium, for which reason modified RPMI 1640 medium was chosen. A pooled protein extract with heavy labeled amino acids was applied as an internal standard, which included proteins expressed under control and stress condition, to control, BIP and BIP-iron-complex (BIP control experiment) samples. Samples were analyzed by liquid chromatography coupled directly to a tandem mass spectrometer. It is described that under iron-restricted conditions proteins associated to pathogenesis are higher abundant in pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus. Hence, similar observations were expected also for the proteomic adaptation of S. pneumoniae, but the first results showed a reduction in protein abundance of virulence factors. In order to explain these results inductively-coupled-plasma mass spectrometry was executed to determine the iron concentration of chemically defined medium (CDM) used in this experiment. The analysis revealed a relatively low iron concentration of approximately 190 µg l-1. Therefore, the iron concentration of the complex medium THY, in which pneumococci are usually grown, was investigated. THY contains four-fold (740 µg l-1) more iron than the CDM. Subsequently, an additional iron limitation approach was carried out in THY. As SILAC is not applicable in complex media like THY, MaxLFQ was applied as quantification method in this case. Because two different media were used, an additional comparative proteome analysis with regard to the two investigated media was executed. Comparing the protein composition in both cultivation media it became clear that pneumococci exhibit a totally different proteome depending on the medium. Major differences were found in metabolisms of amino acids, vitamins and cofactors as well as in pathogenesis-associated proteins. These differences have to be taken into account during the analyses of both iron limitation approaches. Overall, more proteins were identified and quantified in CDM samples. The pneumococcal adaptation to iron limitation in both media was different; especially, the alterations in protein abundances of virulence factors. In contrast to the iron limitation in CDM, proteins involved in pathogenesis were higher abundant under iron limitation in THY, which was the expected result. Because of proteomic changes of cell division and lipid metabolism involved proteins in iron-limited pneumococci in CDM, electron microscopic pictures were taken in order to proof cell morphology. The pictures showed an impaired cell division in iron-limited CDM, but not in THY medium. However, both datasets have similarities as well. Thus, the iron uptake protein PiuA is strongly increased in iron-restricted conditions and the abundance of the iron storage protein Dpr is significantly decreased in both datasets. Notably, PiuA and Dpr seem to have important roles during the pneumococcal adaptation to iron-restricted environments. One the basis of these results, it could be shown that the proteomic response of pneumococci to iron limitation is strongly dependent to the initial iron concentration of the environment. Hence, pneumococci will adapt differently to varying niches and thus potential vaccine candidates should be expressed independently of the localization within the human host.Streptococcus pneumoniae ist eines der wichtigsten Humanpathogene, das weltweit zu hohen Krankheits- und Sterblichkeitsraten führt. Der Pneumokokkus kann viele verschiedene Krankheiten verursachen, so zum Beispiel leichtere Infektionen wie Mittelohrentzündungen (Otitis media) und Nasennebenhöhlenentzündungen (Sinusitis) als auch schwerwiegende Krankheiten wie beispielsweise Lungenentzündungen (Pneumonie), Hirnhautentzündungen (Meningitis) und Blutvergiftung (Sepsis). Von diesen Infektionen sind meistens Kleinkinder, Senioren und immunsupprimierte Patienten betroffen. Jedes Jahr werden mehrere tausend Menschen durch Pneumokokken infiziert, obwohl gegen diesen Krankheitserreger Impfstoffe erhältlich sind. Diese Vakzine wirken gegen die Polysaccharide innerhalb der Pneumokokkenkapsel. Dadurch, dass sehr viele verschiedene Serotypen vorhanden sind, ist es nur schwer möglich einen Impfstoff gegen alle vorkommenden Pneumokokkenserotypen zu entwickeln. In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass Serotypen, die von keinem Impfstoff abgedeckt sind, nunmehr häufiger vorkommen. Das verstärkt die Notwendigkeit einen Impfstoff zu produzieren, der nicht gegen Polysaccharide gerichtet ist. Proteine stellen einen alternativen Angriffspunkt für potentielle Impfstoff oder auch Wirkstoffziele dar. Mithilfe von Proteomanalysen können Einblicke in die Proteinzusammensetzungen von Bakterien, die unter bestimmten Bedingungen gewachsen sind, gewonnen werden. So können Zielproteine identifiziert werden, die besonders unter infektionsrelevanten Bedingungen exprimiert werden. Eisenmangel ist eine dieser infektionsrelevanten Bedingungen. Das Wissen über Eisenaufnahmemechanismen in Pneumokokken ist bisher noch eingeschränkt. Eisen ist ein Spurenelement, das als redoxaktiver Katalysator als auch als Kofaktor in unterschiedlichen, metabolischen Wegen von fast allen Lebewesen und insbesondere von Bakterien involviert ist. So zum Beispiel ist Eisen während der Aminosäurebiosynthese, als auch während des Elektronentransports und bei der DNA-Replikation beteiligt. Innerhalb des humanen Wirts ist freies Eisen, aufgrund dessen geringer Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen und durch eisenbindende Proteine, die einen Teil der humanen Immunabwehr darstellen, extrem limitiert. Deshalb haben Bakterien Mechanismen entwickelt, um den Eisenmangel zu überwinden. In dieser Arbeit wurde der Anpassungsprozess von dem S. pneumoniae Serotyp-2-Stamm D39 an Eisen-limitierte Umgebungen in einer umfassenden Massenspektrometrie basierten Proteomanalyse untersucht. Zunächst wurde das Pneumokokkenwachstum in Wachstumsversuchen an die Bedürfnisse der proteomanalytischen Arbeitsprozesse angepasst. Um die proteomische Antwort auf Eisenlimitation in Pneumokokken zu untersuchen, wurde der organische Eisenchelator 2,2‘- Bipyridin (BIP) eingesetzt. Für die relative Quantifizierung von Änderungen der Proteinmengen im Vergleich von Stress- zu Kontrollbedingungen wurde das sehr zuverlässige und robuste metabolische Markierungsverfahren SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, Stabile Isotopenmarkierung mittels Aminosäuren in Zellkulturen) verwendet. Eine Voraussetzung dieser Methode ist die Anwendung eines chemisch definierten Mediums (CDM), weshalb das modifiziert RPMI 1640-Medium ausgewählt wurde. Ein gemischter Proteinextrakt, der schwer markierte Aminosäuren enthält, ist als interner Standard zu den Kontroll-, BIP- und BIP-Komplexproben hinzugegeben worden. Der interne SILAC-Standard ist eine Vereinigung möglichst aller Proteine, die sowohl unter Kontroll- als auch unter Stressbedingungen in schwer markierten CDM von Pneumokokken exprimiert wurden. Die Peptidproben wurden mittels Flüssigkeitschromatografie mit Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Aus früheren Studien, beispielsweise in Staphylococcus aureus ist bekannt, dass unter Eisen-limitierenden Bedingungen Pathogenese-assoziierte Proteine im Vergleich zu Kontrollbedingungen deutlich erhöht sind. Aus diesem Grund wurden auch für die Anpassung der Pneumokokken ähnliche Ergebnisse erwartet. Allerdings wiesen die ersten Resultate eine Reduktion der Virulenzfaktoren auf. Um diese Ergebnisse zu verstehen, wurde die Eisenkonzentration des CDMs mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) bestimmt. Es zeigte sich, dass die Eisenkonzentration mit 190 μg l-1 im Medium relativ gering ist. Deshalb wurde auch die Eisenkonzentration des komplexen Mediums THY bestimmt, in welchem Pneumokokken für gewöhnlich kultiviert werden. THY hat in etwa eine vierfach höhere Eisenkonzentration (740 μg l-1) als CDM. Anschließend wurde der Eisenlimitationsversuch auch in THY durchgeführt. Da in diesem Medium die SILACMethode nicht angewendet werden kann, wurde auf die markierungsfreie Methode MaxLFQ zurückgegriffen. Dadurch, dass zwei grundverschiedene Medien untersucht wurden, wurde eine weitere Proteomanalyse, die die Proteinzusammensetzung der Pneumokokken in Abhängigkeit des Wachstumsmediums miteinander vergleicht, durchgeführt. Wie zu erwarten war, wiesen die Pneumokokken im Vergleich der Proteinzusammensetzung in beiden Medien eine unterschiedliche Proteinexpression auf. Vor allem wurden im Aminosäuremetabolismus als auch im Metabolismus von Vitaminen und Kofaktoren und auch bei Pathogenese-assoziierten Proteinen große Unterschiede festgestellt. Diese Unterschiede müssen zur Interpretation der beiden Eisenmangelexperimente berücksichtigt werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Insgesamt konnten wesentlich mehr Proteine im CDM identifiziert als auch quantifiziert werden. Des Weiteren war die Anpassung der Pneumokokken an die Eisenlimitation in den beiden Medien unterschiedlich. Dabei sind besonders die gegensätzlichen Proteinmengen der Virulenzfaktoren aufgefallen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Eisenlimitation in CDM, wurden Pathogenese-assoziierte Proteine im Eisen-limitierten THY deutlich stärker exprimiert. Dieses Ergebnis entsprach den Erwartungen, wie zuvor beschrieben. Zusätzlich wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt, nachdem im CDM-Datensatz auffallende Veränderungen bezüglich der Zellteilung deutlich geworden sind. Tatsächlich konnte man in den Bildern der Eisen-limitierten CDM-Proben eine gestörte Zellteilung der Pneumokokken feststellen. Diese Beobachtungen wurden bei Eisen-limitierten Pneumokokken, die in THY gewachsen sind, nicht gemacht. Auch die dazugehörigen Proteomdaten wiesen keine deutlichen Veränderungen der Proteinmengen auf. Neben den genannten Unterschieden zeigten sich in beiden Datensätzen auch Gemeinsamkeiten. So war zum einen die Menge des Eisentransportproteins PiuA nach Eisenlimitation in beiden Medien stark erhöht und zum anderen die Menge des Eisenspeicherproteins Dpr signifikant verringert. Insbesondere scheinen diese beiden Proteine, PiuA und Dpr, wichtige Rollen während der Anpassung an Eisenmangel innezuhaben. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die proteomische Antwort der Pneumokokken auf Eisenlimitation von der Ausgangseisenkonzentration abhängig ist. Daraus lässt sich schließen, dass die Anpassung von S. pneumoniae an das Nährstoffangebot in den verschiedenen Wirtsnischen unterschiedlich sein könnte. Aus diesem Grund wäre es von Vorteil, wenn potentielle Vakzinkandidaten, unabhängig vom Nährstoffangebot der Umgebung im humanen Wirt, exprimiert werden