Delineating the interaction of pneumococcal virulence factors with host eukaryotic cells mediated by matricellular proteins fibronectin and vitronectin

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind human-spezifische Pathobionten, die einerseits die oberen Atemwege kolonisieren, aber andererseits schwerwiegende lokale und invasive Infektionen beim Menschen verursachen. Pneumokokken exprimieren für die Kolonisierung und Pathogenese ein Repertoire an Kolonisierungs- und Virulenzfaktoren auf der Bakterienoberfläche. In dieser Studie wurden die molekularen Wechselwirkungen von zwei wichtigen Virulenzfaktoren, dem „pneumococcal virulence factor A“ (PavA) und „pneumococcal virulence factor B“ (PavB), mit den Matrixproteinen Fibronektin (Fn) und Vitronectin (Vn) untersucht. PavA und PavB sind sogenannte „microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules” (MSCRAMMs), die verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix bzw. des Serums binden und für die Pathogenese ausnutzen. PavA und PavB stellen in Bezug auf ihre Struktur und Assoziation mit der Pneumokokkenoberfläche zwei verschiedene Proteine dar. PavA ist ein nicht-klassisches Oberflächenprotein (NCSP), dessen Sekretion und Verankerung nicht aufgeklärt ist, während PavB ein charakteristisches MSCRAMM ist, das über Sortase A kovalent an das Peptidoglykan der Pneumokokken gebunden ist. PavB besteht neben dem Signalpeptid und der C-terminalen Verankerungsdomäne aus sich wiederholenden Peptidrepeats, die als „streptococcal surface repeats“ (SSURE) bezeichnet werden. Pneumokokken interagieren bevorzugt mit immobilisiertem humanem Fn. In vitro Infektionen in der Zellkultur zeigen, dass die Anheftung von Pneumokokken an die Wirtszellen in Gegenwart von zellgebundenem Fn erleichtert und unabhängig vom eukaryotischen Wirtszelltyp ist. Diese Interaktion ist keine Spezies-spezifische Interaktion. Durchflusszytometrische und Western-Blot Analysen zeigten, dass Pneumokokken auch die lösliche Form des Fibronektinmoleküls binden. Dabei war die Bindung dosisabhängig und mit einer Präferenz für das humane Fn. Die molekularen Wechselwirkungen von PavA und PavB bzw. den SSURE Domänen mit Fn wurde in komplementären Protein-Protein-Interaktionsstudien analysiert. So wurde in Ligand-Overlay-Assays, Oberflächenplasmonresonanzstudien und SPOT-Peptid-Arrays gezeigt, dass PavA und PavB mindestens 13 der 15 Typ-III-Fibronektin-Domänen im C-terminalen Bereich des humanen Fibronektinmoleküls erkennen. Interessanterweise binden die beiden Fibronektin-bindenden Proteine (FnBPs) PavA und PavB ähnliche Peptide in den Fn Typ-III-Repeats. Strukturelle Vergleiche zeigten, dass die Typ-III-Epitope auf den inneren Stränge beider β-Blätter, die die Fibronektin-Domänen bilden, lokalisiert werden können. Die Spezifität der Interaktion wurde durch die direkte Bindung von synthetischen Peptiden von FnIII1, FnIII5 oder FnIII15 an die FnBPs PavA bzw. PavB nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studien ein konserviertes und/oder gemeinsames Muster der molekularen Wechselwirkung der Pneumokokken-FnBPs PavA und PavB mit dem Fibronektinmolekül auf. Zusätzlich zu Fn interagiert PavB mit anderen Wirtsproteinen wie dem humanem Plasminogen (Plg) und humanem Thrombospondin-1 (hTSP-1). Für die S. pneumoniae Proteine PspC und dem PspC-ähnlichen Hic wurde bereits gezeigt, dass sie mit hTSP-1 sowie menschlichem Vn interagieren können. Diese Ergebnisse deuteten eine redundante Funktion der MSCRAMMs an. In dieser Studie wurde die Rolle von PavB als Bindungsprotein für Vitronektin (VnBP) untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse bestätigte PavB als VnBP, da Pneumokokken, die durch Mutagenese kein PavB exprimierten, eine signifikant verminderte Fähigkeit der Vitronektinbindung im Vergleich zu Wildtyp-Pneumokokken zeigten. Bei der Verwendung einer Doppelmutante, die weder PavB noch das VnBP PspC exprimierte, konnte die Bindung von Vitronektin nahezu vollständig reduziert werden. Die direkten Protein-Protein-Interaktionsstudien wie der Liganden-Overlay, ELISA sowie Oberflächenplasmonresonanzstudien bewiesen die Wechselwirkung von PavB SSURE-Domänen sowohl mit löslichem als auch mit immobilisiertem Vn. Die Bindungsaktivität ist jedoch abhängig von der Anzahl der SSURE-Domänen, wobei fünf SSURE Domänen die höchste Bindungsaktivität gegenüber Vn zeigten. Die Wechselwirkung von PavB mit Vitronektin ist ladungsabhängig und kann durch Heparin inhibiert werden. Die Bedeutung der Heparinbindungsdomänen von Vitronektin für die PavB-Vn Interaktion wurde ebenfalls über Protein-Protein-Interaktionsstudien analysiert. Die Untersuchungen mit verkürzten rekombinanten Vn-Fragmenten zeigten, dass PavB, ebenso wie PspC, die C-terminale Heparin-bindende Domäne (HBD3) von Vitronektin erkennt. Daher deuten diese Ergebnisse auf einen konservierten Mechanismus der Interaktion von Pneumokokken-Proteinen mit Vitronektin hin. Zusätzlich zu seiner Funktion als MSCRAMM besitzt PavB die Fähigkeit direkt an Wirts-epithelzellen zu binden. Der zelluläre Rezeptor für PavB war bislang unbekannt und daher war das Ziel dieser Studie, den/die Zellrezeptor(en) für PavB zu identifizieren. Die Adhärenzstudien mit Epithelzellen bestätigten, dass PavB auch in Abwesenheit eines ECM bzw. eines molekularen Brückenmoleküls die Anheftung an respiratorische Epithelzellen vermittelt. Die direkte Wechselwirkung zwischen PavB und den Wirtsepithelzellen wurde durch die Verwendung von Cy5-markiertem PavB-Protein in der Durchflusszytometrie analysiert und bestätigt. Interessanterweise hemmte exogen zugegebenes humanes Vitronektin die Bindung von PavB an die verwendeten Wirtsepithelzellen. Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass der wichtigste zelluläre Rezeptor für Vitronektin, das αvβ3-Integrin, ein potentieller Rezeptor für PavB ist. Diese Hypothese wurde durch funktionelle Inhibitionsstudien mit monoklonalen Antikörpern, die spezifische Integrin-Untereinheiten erkennen, unterstützt. Die Ergebnisse zeigten eine reduzierte Bindung von PavB in Gegenwart von blockierenden Antikörpern, die das αv-Integrin erkennen. Das PavB das αvβ3-Integrin als Rezeptor auf eukaryotischen Zellen erkennt, wurde des Weiteren über einen direkten Bindungsassay mit embryonalen Fibroblasten aus Mäusen (MEFs) bestätigt. In den MEFs fehlte das Integrin αvβ3 und eine deutliche Abnahme der Bindung von PavB im Vergleich zu Integrin αvβ3 positiven Zellen konnte nachgewiesen werden. Obwohl die funktionellen inhibitorischen Studien und die Bindungsstudien mit MEFs die Rolle von αvβ3-Integrin als Rezeptor für PavB unterstützten, konnte ein Knockdown des αv-Integrin in Epithelzellen mittels RNA-Interferenz die Bindung von PavB im Vergleich zu den Kontrollzellen nicht signifikant vermindern. Die direkte Interaktion zwischen dem αvβ3-Integrin und PavB von S. pneumoniae wurde mittels Oberflächenplasmonresonanzanalysen bewiesen. Damit zeigt diese Studie zum ersten Mal die direkte Wechselwirkung eines Gram-positiven extrazellulären Pathogens, nämlich Streptococcus pneumoniae, mit einem der Wirts-ICAMs, dem αvβ3-Integrin. Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Studie wichtige Aspekte der molekularen Wechselwirkung von Pneumokokken MSCRAMMs PavA und PavB mit den humanen Proteinen Fibronektin bzw. Vitronektin analysiert. Die Interaktion von PavA und PavB konnte auf die C-terminalen FnIII-Repeats eingegrenzt werden und die HBD3 des Vitronektinmoleküls wurde als wichtige Bindungsdomäne für die Interaktion mit PavB identifiziert. Darüber hinaus konnte in dieser Studie der zelluläre Rezeptor αvβ3-Integrin für das S. pneumoniae Adhäsin PavB identifiziert werden. Der molekulare Mechanismus und die biologische Bedeutung der PavB- αvβ3-Integrin Interaktion für die zelluläre Wirtsantwort muss in zukünftigen Studien aufgeklärt werden.Streptococcus pneumoniae (pneumococci), a human pathobiont, express and expose several proteinaceous colonization and virulence factors on its surface to facilitate on the one hand colonization of the upper respiratory tract and on the other hand pathogenesis in the host. In this study the interaction of two of such factors referred to as pneumococcal virulence factor A (PavA) and pneumococcal virulence factor B (PavB) and acting as microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs), was delineated with the two host matricellular proteins fibronectin (Fn) and vitronectin (Vn). Despite similarity in nomenclature, PavA and PavB represent two diverse pneumococcal proteins with respect to their structure and association with the pneumococcal surface. PavA is a non-classical surface protein (NCSP) with an ambiguous mode of secretion and anchorage while PavB is a characteristic MSCRAMM, anchored via sortase A to pneumococcal peptidoglycan. PavB has a signature of repetitive modules termed as streptococcal surface repeats (SSURE). Pneumococci preferentially interact with immobilized human Fn. In vitro cell culture adherence assays demonstrated that cell bound Fn facilitates the adherence of pneumococci to the host cells and this particular interaction is indifferent to host cell type and is species non-specific. Flow cytometry and immunoblot analyses further indicated the ability of pneumococci to interact with the soluble form of Fn in a dose-dependent but species non-specific manner. The molecular interaction of PavA and PavB (via its SSURE domains) with Fn was delineated further in detail via several direct protein-protein interaction approaches. Ligand overlay assays, surface plasmon resonance studies and SPOT peptide arrays demonstrated that PavA and PavB target at least 13 out of the 15 type III fibronectin domains located in the C-terminal part of Fn. Strikingly, both pneumococcal fibronectin-binding proteins (FnBPs) recognize similar peptides in targeted type III repeats. Structural comparisons revealed that the targeted type III epitopes cluster on the inner strands of both β-sheets forming the fibronectin domains. Importantly, synthetic peptides of FnIII1, FnIII5 or FnIII15 bind directly to FnBPs PavA and PavB, respectively. Thus, analysis of interaction of pneumococcal FnBPs PavA and PavB revealed a probable conserved and/or common pattern of molecular interaction with human Fn. In addition to Fn, pneumococcal PavB interacts with other host matricellular proteins such as human plasminogen (Plg) and human thrombospondin-1 (hTSP-1). Pneumococcal proteins such as PspC and PspC-like Hic have earlier been demonstrated to interact with hTSP-1 as well as human Vn, thereby depicting a redundant function as MSCRAMMs. In this study the role of PavB as a pneumococcal vitronectin binding protein (VnBP) was assessed. Flow cytometric analysis suggested PavB as VnBP, because strains deficient for PavB exhibited a significantly decreased ability to acquire vitronectin compared to wild-type pneumococci. When using a double knockout, deficient in expression of PavB and the VnBP PspC, the pneumococcal interaction with vitronectin was completely abolished. The direct protein-protein interaction assays such as far western ligand overlay, ELISA, and surface plasmon resonance indicated the interaction of SSURE domains with both soluble and immobilized Vn. However, the binding activity depends on the number of SSURE domains with five SSURE showing the highest binding activity to Vn. The interaction of PavB with Vn was charge dependent and heparin sensitive as analyzed by ELISA. The importance of the heparin binding domains of Vn in this interaction was further analyzed via direct protein-protein interaction approaches. Binding studies (far western ligand overlay, ELISA, and surface plasmon resonance) with truncated recombinant Vn fragments indicated that PavB targets the C-terminal heparin-binding domain (HBD3) of vitronectin, a characteristic shared with PspC, hence, suggesting a conserved molecular interaction of pneumococci with Vn. In addition to its function as an MSCRAMM, PavB has the capability to interact directly with host epithelial cells via an unknown cellular receptor. Thus, this study aimed to identify cellular receptor(s) for PavB. In vitro cell culture adherence and invasion assays confirmed that pneumococcal PavB is involved in promoting pneumococcal adherence to respiratory epithelial cells without employing any molecular bridge. The direct interaction between PavB and host epithelial cells was further confirmed via direct binding assays when using Cy5-labeled PavB and flow cytometric analysis. Strikingly, exogenously added human vitronectin competitively inhibited binding of PavB to respiratory epithelial cells. This observation led us to hypothesize that the major vitronectin receptor αvβ3 integrin acts as a potential receptor for PavB. This hypothesis was supported by functional blocking assays with monoclonal antibodies recognizing specific integrin subunits. The results revealed reduced binding of PavB in the presence of bound antibodies recognizing αv integrin indicating that PavB employs αvβ3 integrin as its direct receptor on eukaryotic cells. This was further confirmed via a direct binding assay of PavB to mouse embryonic fibroblasts (MEFs) where cells lacking αvβ3 demonstrated a marked decrease in binding to PavB. Although functional blocking assay and direct binding assay with MEFs supported the role of αvβ3 integrin as a direct adhesin for PavB, RNA interference of αv integrin in epithelial cells did not impair the binding of PavB in αv-knocked down cells in comparison to non-transfected cells. Finally, surface plasmon resonance (SPR) analysis indicated the direct interaction between pneumococcal PavB and recombinant αvβ3 integrin. In this study we report for the first time the interaction of a Gram-positive extracellular pathogen, namely Streptococcus pneumoniae, with one of the host ICAMs, namely the αvβ3 integrin. In conclusion, the present study analysed some of the aspects of molecular interaction of pneumococcal MSCRAMMs PavA and PavB with hFn and hVn. The hot spots of interaction on C-terminal FnIII repeats were delineated for PavA and PavB. HBD3 was revealed to be pivotal for PavB-Vn interaction. In addition the redundant role of pneumococcal PavB as an MSCRAMM was demonstrated. Furthermore this study successfully identifies a direct receptor for pneumococcal PavB, namely αvβ3 integrin. The mechanism and biological rationale of this newly identified interaction is a matter of debate and awaits further scientific analyses