Proteomic investigation of serine/threonine phosphorylation in Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae is a commensal of the human upper respiratory tract and moreover, the causative agent of several life-threatening diseases including pneumonia, sepsis, otitis media, and meningitis. Due to the worldwide rise of resistance to antibiotics in pneumococci the understanding of its physiology is of increasing importance. In this context, the analysis of the pneumococcal proteome is helpful as comprehensive data on protein abundances in S. pneumoniae may provide an extensive source of information to facilitate the development of new vaccines and drug treatments. It is known that protein phosphorylation on serine, threonine and tyrosine residues is a major regulatory post-translational modification in pathogenic bacteria. This reversible post-translational modification enables the translation of extracellular signals into cellular responses and therewith adaptation to a steadily changing environment. Consequently, it is of particular interest to gather precise information about the phosphoproteome of pneumococci. S. pneumoniae encodes a single Serine/Threonine kinase-phosphatase couple known as StkP-PhpP. To address the global impact and physiological importance of StkP and PhpP which are closely linked to the regulation of cell morphology, growth and cell division in S. pneumoniae, proteomics with an emphasis on phosphorylation and dephosphorylation events on Ser and Thr residues was applied. Thus, the non-encapsulated pneumococcal D39Δcps strain (WT), a kinase (ΔstkP) and phosphatase mutant (ΔphpP) were analyzed in in a mass spectrometry based label-free quantification experiment. The global proteome analysis of the mutants deficient for stkP or phpP already proved the essential role of StkP-PhpP in the protein regulation of the pneumococcus. Proteins with significantly altered abundances were detected in diverse functional groups in both mutants. Noticeable changes in the proteome of the stkP deletion mutant were observed in metabolic processes such as “Amino acid metabolism” and also in pathways regulating genetic and environmental information processing like “Transcription” and “Signal transduction”. Prominent changes in the metabolism of DNA, nucleotides, carbohydrates, cofactors and vitamins as well as in the categories “Transport and binding proteins” and “Glycan biosynthesis and metabolism” have been additionally detected in the proteome of the phosphatase mutant. Still, the quantitative comparison of WT and mutants revealed more significantly altered proteins in ΔphpP than in ΔstkP. Moreover, the results indicated that the loss of function of PhpP causes an increased abundance of proteins in the pneumococcal phosphate uptake system Pst. Furthermore, the obtained quantitative proteomic data revealed an influence of StkP and PhpP on the twocomponent systems ComDE, LiaRS, CiaRH, and VicRK. Recent studies of the pneumococcal StkP/PhpP couple demonstrated that both proteins play an essential role in cell growth, cell division and separation. Growth analyses and the phenotypic characterization of the mutants by electron-microscopy performed within this work pointed out that ΔphpP and ΔstkP had different growth characteristics and abnormal cell division and cell separation. Nevertheless, the morphological effects could not be explained by changes in protein abundances on a global scale. So, the in-depth analysis of the phosphoproteome was mandatory to deliver further information of PhpP and StkP and their influence in cell division and peptidoglycan synthesis by modulating proteins involved in this mechanisms. For more detailed insights into the activity, targets and target sites of PhpP and StkP the advantages of phosphopeptide enrichment using titanium dioxide and spectral library based data evaluation were combined. Indeed, the application of an adapted workflow for phosphoproteome analyses and the use of a recently constructed broad spectral library, including a large number of phosphopeptides (504) highly enhanced the reliable and reproducible identification of phosphorylated proteins in this work. Finally, already known targets and target sites of StkP and PhpP, detected and described in other studies using different experimental procedures, have been identified as a proof of principle applying the mass spectrometry based phosphoproteome approach presented in this work. Referring to the role of StkP in cell division and cell separation a number of proteins participating in cell wall synthesis and cell division that are apparently phosphorylated by StkP was identified. In comparison to StkP, the physiological function and role of the co-expressed phosphatase PhpP is poorly understood. But, especially the list of previously unknown putative target substrates of PhpP has been extended remarkably in this work. Among others, five proteins with direct involvement in cell division (DivIVA, GpsB) and peptidoglycan biosynthesis (MltG, MreC, MacP) can be found under the new putative targets of PhpP. All in all, this work provides a complex and comprehensive protein repository of high proteome coverage of S. pneumoniae D39 including identification of yet unknown serine/threonine/tyrosine phosphorylation, which might contribute to support various research interests within the scientific community and will facilitate further investigations of this important human pathogen.Streptococcus pneumoniae ist ein Kommensale der oberen Atemwege des Menschen und darüber hinaus der Erreger mehrerer lebensbedrohlicher Krankheiten, einschließlich Lungenentzündung, Sepsis, Mittelohrentzündung und Meningitis. Aufgrund des weltweiten Anstiegs der Antibiotikaresistenz bei Pneumokokken gewinnt das Verständnis seiner Physiologie zunehmend an Bedeutung. In diesem Zusammenhang ist auch die Analyse des Pneumokokken-Proteoms von großer Wichtigkeit. Ausführliche Daten zur Abundanz bestimmter Proteine in S. pneumoniae können eine umfassende Informationsbasis für die Entwicklung neuer Impfstoffe und Arzneimittelbehandlungen bilden. Dabei ist bekannt, dass die Proteinphosphorylierung an Serin-, Threonin- und Tyrosinresten eine zentrale regulatorische Rolle bei pathogenen Bakterien spielt. Jene reversible posttranslationale Modifikation ermöglicht auch die Übersetzung extrazellulärer Signale in zelluläre Antworten und damit die Anpassung der Bakterien an eine sich ständig ändernde Umgebung. Somit ist es von besonderem Interesse, weiterführende Informationen, vor allem auch über das Phosphoproteom, von Pneumokokken zu sammeln. Im Genom von S. pneumoniae ist ein einzelnes Serin/Threonin- Kinase-Phosphatase-Paar kodiert, das als StkP-PhpP bezeichnet wird. StkP und PhpP werden mit der Regulation der Zellmorphologie, des Wachstums und der Zellteilung bei S. pneumoniae in Verbindung gebracht. Um ihren globalen Einfluss und die physiologische Relevanz näher zu charakterisieren, wurden aktuelle Methoden der mikrobiellen Proteomik mit Schwerpunkt auf Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignissen an Ser- und Thr-Seitenketten angewendet. Mittels Massenspektrometrie wurden der unbekapselte Pneumokokken-Stamm D39Δcps (WT), eine Kinase- (ΔstkP) und eine Phosphatase-Mutante (ΔphpP) analysiert. Zur Untersuchung von Unterschieden in Proteinabundanzen zwischen dem Wildtyp und den Mutanten wurde eine markierungsfreie Quantifizierungsstrategie gewählt. Bereits die globale Proteomanalyse der Deletions-Mutanten hat eine tragende Rolle von StkP-PhpP bei der Proteinregulation in Pneumokokken herausgestellt. Proteine mit signifikant veränderter Abundanz wurden in beiden Mutanten in verschiedenen funktionellen Kategorien aufgezeigt. Auffällige Veränderungen im Proteom der stkP-Deletionsmutante wurden bei Stoffwechselprozessen wie dem „Aminosäuremetabolismus“ und auch bei Wegen zur Regulierung der Verarbeitung genetischer und umweltbezogener Informationen wie „Transkription“ und „Signaltransduktion“ beobachtet. Im Proteom der Phosphatase-Mutante wurden zusätzlich deutliche Veränderungen im Metabolismus von DNA, Nukleotiden, Kohlenhydraten, Cofaktoren und Vitaminen sowie in den Kategorien „Transport- und Bindungsproteine“ und „Glycan-Biosynthese und -Metabolismus“ festgestellt. Der quantitative Vergleich von WT und Mutanten offenbarte zudem, dass deutlich mehr statistisch signifikant veränderte Proteine in ΔphpP als in ΔstkP auftraten. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass der Funktionsverlust von PhpP eine erhöhte Abundanz von Proteinen im Phosphat-Aufnahmesystem Pst innerhalb der Pneumokokken verursacht. Des Weiteren verdeutlichten die quantitativen Proteomdaten, dass StkP und PhpP im Zusammenhang mit der Regulation der Zweikomponentensysteme ComDE, LiaRS, CiaRH und VicRK stehen. Jüngste Studien des Pneumokokken-StkP/PhpP-Paares zeigten, dass beide Proteine eine wesentliche Rolle beim Zellwachstum, der Zellteilung und -trennung einnehmen. Wachstumsanalysen und die phänotypische Charakterisierung der Mutanten durch Elektronenmikroskopie, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, zeigten, dass die Mutanten ΔphpP und ΔstkP deutlich unterschiedliche Wachstumseigenschaften, eine abnormale Zellteilung und Zelltrennung aufwiesen. Diese morphologischen Effekte ließen sich jedoch nicht auf Veränderungen der Proteinzusammensetzung und -abundanz auf globaler Ebene zurückführen. Von daher war die eingehende Analyse des Phosphoproteoms unabdingbar, um weitere Hinweise zu PhpP und StkP und ihren Einfluss auf die Zellteilung und Peptidoglykansynthese durch Modifikation der an diesen Mechanismen beteiligten Proteine zu liefern. Um einen detaillierteren Einblick in die Aktivität und die Substrate von PhpP und StkP zu erhalten, wurde eine Anreicherung der phosphoryltierten Peptide mit Hilfe von Titandioxid durchgeführt. Zudem wurde der Versuchsansatz mit einer Spektrenbibliotheks basierten Datenauswertung zur Verbesserung der Phosphopeptididentifizierung kombiniert. Die Anwendung eines angepassten Arbeitsablaufs für die Phosphoproteomanalyse bei Pneumokokken und die Nutzung einer neu konstruierten umfassenden Spektrenbibliothek, die eine besonders hohe Anzahl von Phosphopeptiden (504) enthält, verbesserten die zuverlässige und reproduzierbare Identifizierung von phosphorylierten Proteinen in dieser Arbeit erheblich. Schließlich konnten bereits aus anderen Studien, mit anderen experimentellen Verfahren nachgewiesenen StkP- und PhpP- Substrate mit entsprechenden Phosphorylierungsstellen identifiziert und bestätigt werden. In Anbetracht des Einflusses von StkP auf die Zellteilung und Zelltrennung konnte eine Reihe von Proteinen detektiert werden, die an der Zellwandsynthese und Zellteilung beteiligt sind und offensichtlich durch StkP phosphoryliert werden. Im Vergleich zu StkP ist die physiologische Funktion und Bedeutung der co-exprimierten Phosphatase PhpP nur wenig erforscht. Insbesondere die Liste der bisher unbekannten potentiellen Substrate von PhpP konnte im Rahmen dieser Arbeit erheblich erweitert werden. Zu den neuen potentiellen Substraten von PhpP zählen unter anderem fünf Proteine mit direkter Beteiligung an der Zellteilung (DivIVA, GpsB) und der Peptidoglykan-Biosynthese (MltG, MreC, MacP). Alles in allem stellt diese Arbeit ein komplexes und umfassendes Protein-Repositorium mit hoher Proteomabdeckung von S. pneumoniae D39, einschließlich der Identifizierung bisher unbekannter Serin/Threonin/Tyrosin-Phosphorylierungsstellen zur Verfügung. Dies kann zur Unterstützung verschiedener Forschungsinteressen innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft beitragen und die Untersuchung jenes wichtigen humanpathogenen Erregers vorantreiben