Deciphering the influence of Streptococcus pneumoniae global regulators on fitness and virulence

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae; the pneumococcus) is a Gram-positive, aerotolerant, and opportunistic bacteria, which colonizes the upper respiratory tract of human. S. pneumoniae can further migrate to other sterile parts of the body, and causes local as well as fatal infections like, pneumonia, septicaemia and meningitis. Due to incomplete amino acid pathways, pneumococci are auxotrophic for eight different amino acids including glutamine and arginine. The pneumococcus has adapted to the various host environmental conditions and a number of systems are dedicated for the transport and utilization of nutrients such as monosaccharides, amino acids and oligopeptides. In this study the amino acid metabolism was characterised by 15N-isotopologue profiling in two different pneumococcal strains, D39 and TIGR4. Efficient uptake of a labelled amino acids mixture of 15N-labelled amino acids showed that S. pneumoniae has a preference for the amino acids transport instead of a de novo biosynthesis. It is known that glutamine (Gln) serves as main nitrogen source for S. pneumoniae. The 15N-labelled Gln used in this study demonstrated an efficient 15N-enrichment of Glu, Ala, Pro and Thr. Minor enrichment was seen for the amino acids Asp, Ile, Leu, Phe, Tyr, and Val. Remarkably, labelled Gly and Ser could be determined in strain TIGR4, whereas for strain D39 these two labelled amino acids were not detected. This confirms earlier studies with 13C-labelled glucose, which showed the biosynthesis of Ser out of Gly. Strain TIGR4 was able to grow in chemically-defined medium depleted of Gly confirming that Gly can be synthesized out of serine by the action of the enzyme serine hydroxymethyltransferase (SHMT). The transcriptional regulator GlnR controls the Gln and Glu metabolism in S. pneumoniae. Hence, the impact of the repressor GlnR on amino acids metabolism was also studied. An increased 15N-enrichment was determined for Ala and Glu in both used pneumococcal strains, while an increased level of Pro was only measured in the isogenic glnR-mutant of non-encapsulated D39. Arginine can also serve as nitrogen source in strain TIGR4. The arginine deiminase system metabolizes Arg into ornithine, carbamoyl phosphate and CO2 by the generation of 1 ATP and 2 mol NH3. Because of the truncation of the arcA gene strain D39 lacks arginine deiminase activity and has thus no functional ADS system. When 15N-Arg was added for growth, only in strain TIGR4, thirteen (13) labelled amino acids were detected with the highest enrichment for Ala, Glu and Thr. Genes coding for the enzymes of the arginine metabolism and for arginine uptake are regulated by the activator ArgR2 in strain TIGR4. Inactivation of ArgR2 was not accompanied by an enrichment of labelled amino acids, when the argR2-mutant was grown with 15N-labelled Arg indicative of the important role of ArgR2. The bicistronic operon arcDT encoding the arginine/ornithine transporter ArcD and a putative peptidase ArcT belong to the peptidase family M20. The in silico comparison of structures revealed a significant homology of ArcT to PepV of L. delbrueckii and to Sapep of S. aureus known as carboxypeptidase. ArcT was heterologously expressed in E. coli and purified under reducing conditions. An enzymatic reaction was established and several dipeptides like Ala-Arg, Arg-Ala, and Ala-Asp were used as substrates. In addition, the dependency on divalent cations was analysed. Cleavage of the dipeptide Ala-Arg was detected in the presence of Mn2+ as cofactor under reducing conditions. Reduced peptidase activity was observed when Zn2+ was added. No cleavage of the tripeptide Ala-Ala-Arg could be shown indicating that ArcT acts as dipeptidase with the preference to the Arg residue at the C-terminal end. Bacterial meningitis caused by S. pneumoniae was studied in an in vivo proteomic analysis. In a mouse meningitis model S. pneumoniae was isolated from the cerebrospinal fluid (CSF) by a filter extraction step. The MS analysis identified AliB and ComDE only from CSF isolated pneumococci indicating that these proteins are expressed under infection conditions. Mice infected with D39 wild-type and isogenic aliB, comDE and aliB-comDE double knockout mutants showed significantly less number of pleocytosis in the CSF and lower bacterial load in the blood compared to the wild-type. The results indicate that AliB and ComDE play an important role during meningitis. Phenotypic characterization was carried out to identify differences between the wild-type and the aliB-, comDE- and aliB-comDE double mutants. Oxidative stress conditions were induced by the application of hydrogen peroxide or paraquat during growth in a chemically-defined medium similar to the CSF. No alteration in growth and survival of these mutants compared to the wild-type was observed suggesting that oxygen radicals play not an important role during the progression of meningitis. In addition, no differences of AliB expression was detected in the ComDE deficient D39. No impact of aliB and comDE-mutation on the expression of different virulence factors like pneumolysin or proteins involved in capsular biosynthesis was detected. In vitro proteome analysis was performed to compare the wild-type to the AliB, and ComDE deficient D39 in the early and mid logarithmic growth phase. More than 70 % of theoretically expressed proteins were identified. In the aliB-mutant 33 proteins were differentally expressed in the early growth phase and 50 proteins differed during mid log growth. For the comDE mutant 24 and 11 proteins differed in expression in these two growth phases. Interestingly, high level of AliA expression was identified in all samples. The aliB-mutant had a decreased abundance of the proteins resembling an oligopeptide ABC transporter (AmiA, AmiC, AmiD, AmiE). In addition, another ABC transporter for iron transport encoded by spd_1607 to spd_ 1610 was higher expressed in the aliB-mutant. In the ComDE deficient mutant lower abundance of the Ami transporter sytem was identified. An increased abundance of proteins involved in the pyrimidine metabolism (PyrF, PyrE, PyrDb, PyrB and PyrR) was recognized only in the early growth phase of the comDE-mutant. These analyses demonstrate the marginal changes in protein synthesis during growth of S. pneumoniae. These studies demonstrated the adaptation of the proteome of S. pneumoniae to different growth conditions and the impact of regulatory proteins on the availability of carbon and nitrogen sources.Streptococcus pneumoniae ist ein Gram positives, aerotolerantes und opportunistisches Bakterium, dass die oberen Luftwege des Menschen besiedelt. Es kann in tiefere respiratorische und normalerweise sterile Wirtskompartimente vordringen und schwere Infektionen, wie eine Lungenentzündung, Sepsis oder eine Meningitis verursachen. Pneumokokken haben keine kompletten Biosynthesewege für acht verschiedene Aminosäuren, darunter die für Glutamin und Arginin. S. pneumoniae kann sich den verschiedenen Wirts spezifischen Umgebungsbedingungen anpassen und besitzt eine Vielzahl spezifischer Transportsysteme zur Aufnahme von Nährstoffen wie Monosaccharide, Aminosäuren und Oligopeptide. Der Aminosäure Metabolismus wurde in zwei verschiedenen S. pneumoniae Stämmen D39 und TIGR4 durch 15N-Markierungsexperimente untersucht. Eine effiziente Aufnahme einer markierten Aminosäure Mixtur von 15 verschiedenen Aminosäuren ergab eine Präferenz für die Aufnahme von Nährstoffen gegenüber der de novo Biosynthese. Bei S. pneumoniae haben bisherige Studien gezeigt, dass Glutamin als Haupt Stickstoffquelle dient. Der Einsatz von 15N-markierten Glutamin ergab einen effizienten Einbau der Markierung in die Aminosäuren Glu, Ala, Pro. Daneben konnten auch die Aminosäuren Asp, Ile, Leu, Phe, Thr, Tyr und Val mit einer geringeren Markierungsrate detektiert werden. In Stamm TIGR4 wurden zusätzlich auch Serin und Glycin als markierte Aminosäure gefunden. Diese Ergebnisse bestätigten auch vorhergehende Markierungs-Experimente mit 13C-markierter Glucose, die zeigten, dass Serin aus Glycin in D39 synthetisiert wird. Das Wachstum vom Stamm TIGR4 in einem chemisch- definierten Medium ohne Glycin zeigte, dass Glycin aus Serin synthetisiert werden kann. Die Synthese wird katalysiert durch die Serin Hydroxymethyltransferase. Der Regulator GlnR kontrolliert den Glutamin und Glutamat Metabolismus in S. pneumoniae. Der Einfluss des Repressors GlnR auf den Aminosäure Metabolismus wurde in dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Die Inaktivierung von GlnR in den S. pneumoniae Stämmen D39 und TIGR4 führte zu einer erhöhten Markierungsrate von Ala und Glu und in D39 zusätzlich zu einer erhöhten Markierung von Pro. Arginin stellt ebenso eine N-Quelle in Stamm TIGR4 dar. Das ADS System kann Arginin in Ornithin, Carbamoyl-P und CO2 umwandeln. Dabei wird 1 ATP und 2 Mol NH3 generiert. Der Pneumokokken-Stamm D39 hat ein unvollständiges arcA Gen und damit kein funktionelles ADS. Das Wachstum von TIGR4 mit 15N markierten Arg ergab eine Markierung von 13 Aminosäuren. Dabei wurden die höchsten Einbauraten bei Ala, Glu und Thr detektiert. Die Gene, die für den Arginin Metabolismus kodieren werden durch den Aktivator ArgR2 im Stamm TIGR4 reguliert. Die Inaktivierung von ArgR2 führte zu keiner Markierung von Aminosäuren bei bakteriellem Wachstum in Gegenwart von 15N markierten Arginin. Das bicistronische Operon arcDT kodiert für einen Ornithin/Arginin Transporter (ArcD) und einer möglichen Peptidase (ArcT), die Ähnlichkeiten zur Peptidase Familie M20 aufweist. Die Computer unterstützten Sequenzanalysen und Strukturvergleiche zeigten eine signifikante Homologie zu der Peptidase PepV aus L. delbrueckii und zu der Carboxypeptidase Sapep aus S. aureus. ArcT wurde heterolog in E. coli exprimiert und unter reduzierenden Bedingungen isoliert. Die enzymatische Aktivität wurde mit verschiedenen Dipeptiden, wie Ala-Arg, Arg-Ala oder Ala-Asp als Substrat untersucht. Zusätzlich wurde die Enzymaktivität in Gegenwart von divalenten Kationen wie Mn2+ oder Zn2+ als Kofaktoren bestimmt. Die Spaltung von Ala-Arg mit Mangan im Ansatz konnte nachgewiesen werden. Mit Zink als Kofaktor wurde eine reduzierte Peptidase Aktivität erhalten. Das Tripeptid Ala-Ala-Arg wurde unter den gewählten Bedingungen nicht gespalten. Das bedeutet, dass ArcT eine Dipeptidase darstellt mit einer Präferenz für Arginin am C-Terminus. Die während einer Pneumokokken-Meningitis exprimierten Proteine wurden durch in vivo Proteomanalysen nach Isolierung der Pneumokokken aus dem Liquor cerebrospinalis (CSF) im exerimentellen Maus-Meningitis-Modell analysiert. Die Pneumokokken wurden nach Isolierung durch einen 2-Schritt Filter Extraktionsschritt von den eukaryotischen Zellen isoliert und einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Dabei wurde AliB als Oligopeptid-Bindungsprotein und ComDE als regulatorisches Protein der Kompetenzentwicklung nur in den Proben aus dem CSF identifiziert. Die Mutation von aliB oder comDE bzw. generierte Doppelmutanten wiesen im experimentellen Meningitis Modell eine erniedrigte Anzahl an Pneumokokken im Blut auf im Vergleich zum Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass AliB und ComDE eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer Pneuokokken-Meningitis spielen. Eine phänotypische Charakterisierung der Mutanten mit einer Defizienz in AliB, ComDE oder beiden Systemen wurde durchgeführt, um Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der aliB, comDE und der Doppelmutante zu finden. Ein oxidativer Stress wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid oder Paraquat während des Wachstums in einem chemisch definierten Medium induziert. Keine Veränderung im Wachstum oder eine verminderte Überlebensrate der Mutanten gegenüber dem Wildtyp konnte identifiziert werden. Dies lässt vermuten, das AliB und ComDE voraussichtlich bei der oxidativen Stressresistenz während einer Pneumokokken-Meningitis keine entscheidende Rolle spielen. Die Expression von AliB war unverändert in der ComDE Mutante. Ebenso wurde kein Einfluß der aliB oder comDE Mutation auf die Expression verschiedener Virulenzfaktoren, wie Pneumolysin oder Proteine, die an der Kapslebildung beteiligt sind, gefunden. In vitro Proteom Analysen wurden durchgeführt, um die Expression in zwei verschiedenen Wachstumsphasen (frühe- und mittlere logarithmische Phase) in den beiden Mutanten mit dem Wildtyp zu vergleichen. Über 70 % aller möglichen exprimierten Proteine konnten identifiziert werden. Bei der aliB Mutante wurden 33 Proteine in der frühen log Phase unterschiedlich exprimiert und 50 Proteine wurden in der mittleren log Phase unterschiedlich exprimiert. Bei der comDE Mutante waren es 24 bzw. 11 Proteine, die unterschiedlich exprimiert wurden. Interessanterweise wurde eine erhöhte AliA Expression in allen Proben identifiziert. Geringere Mengen von AmiA, AmiC, AmiD und AmiE, die Bestandteil eines Oligopeptid ABC Transporters darstellen, wurden in der aliB Mutante detektiert. Zusätzlich wurde eine höhere Menge eines weiteren möglichen Fe3+ ABC Transporters, kodiert durch die Gene spd_1607 - spd_1609, in der aliB Mutante gemessen. Die comDE Mutante wies eine geringere Menge von Proteinen des Ami Oligopeptid ABC-Transporters auf. Eine höhere Menge von Proteinen, die den Pyrimidin Metabolismus katalysieren (PyrF, PyrE, PyrDb, PyrB und PyrR) wurde nur in der frühen log Phase in der comDE Mutante festgestellt. Die Analysen zeigen auch die Veränderungen der Proteinsynthese während des logarithmischen Wachstums von S. pneumoniae. Mit diesen Studien konnte gezeigt werden, wie sich S. pneumonaie an verschiedene Wachstumsbedingungen durch Veränderung des Proteoms anpassen kann, und welchen Einfluß regulatorische Proteine auf die Verwertung verfügbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen haben