Secreted aspartate proteases of Candida albicans and their importance as virulence factors

Titel I-III Inhaltsverzeichnis IV-VII Zusammenfassung IX-XII Summary XIII-XV Einleitung 1-19 Material and Methoden 20-53 Ergebnisse 54-107 Diskussion 108-132 Literaturverzeichnis 133-152 Anhang 153-159Die Anzahl lebensbedrohlicher Mykosen ist in den letzten Jahren dramatisch gestiegen. Unter anderen human pathogenen Pilzarten gehört auch Candida albicans zu denen, die die meisten Rezidiven hervorrufen. C. albicans gehört zu sogenannten opportunistischen Pilzen, die zu den kommensalen Organismen gehören und bei gesunden Menschen harmlos sind. Im Fall einer krankhaften oder medikamentös hervorgerufenen Dysfunktion des Immunsystems oder aber einer Gleichgewichtsstörung der Mikroflora infolge einer Antibiotikabehandlung ist der Pilz in der Lage, in die tieferen Gewebe und Blutgefäßsystem einzudringen und gefolgt davon schwere systemische Mykosen hervorzurufen. Die Forschung an C. albicans konzentriert sich weitgehend auf die Untersuchung der Virulenzfaktoren, die dem Pilz das Eindringen in den Wirtsorganismus ermöglichen. Die sekretorischen Aspartat-Proteasen gehören zu den meist diskutierten Virulenzfaktoren. Sie tragen zum Abbau der Wirtsproteine bei und fördern damit die Invasion des Pilzes. C. albicans besitzt eine Genfamilie mit zehn Genen für sekretorische Aspartat-Proteasen (SAP), die von dem Pilz unterschiedlich eingesetzt werden können. Da die einzelnen Mitglieder dieser Genfamilie im Laufe der Jahre nacheinander identifiziert wurden, gibt es keine systematische Untersuchung, die alle Proteasen dieser Familie abdeckt. Das erste Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung des Expressionsprofils aller bekannten SAP-Gene in vitro unter verschiedenen Umweltbedingungen. Ein weiterer Schwerpunkt wurde auf die Untersuchung des Expressionsmusters in vivo während Infektionen gelegt. Dabei wurde das dynamische Expressionsverhalten von SAP-Genen bei intra peritonealen Mausinfektionen untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Gene SAP9 und SAP10 charakterisiert und in Bezug auf die proteolytischen Eigenschaften funktionell untersucht. Unter den gewählten in vitro Bedingungen, wie Myzelinduktion, Wachstum in Protein- bzw. Ammoniumsulfat-haltigen Medien als einziger Stickstoffquelle und phänotypischer Wechsel, wurden die Expressionsprofile einzelner SAP-Gene in C. albicans mittels RT-PCR untersucht. Dabei konnte die meiste Expression der SAP-Gene in Medium mit Protein als einziger Stickstoffquelle festgestellt werden, welches als Protease-induzierend gilt. Dagegen wurde bei Abwesenheit von Protein in Minimalmedium mit Ammoniumsulfat als einziger Stickstoffquelle die Transkription vieler SAP-Gene herabreguliert. Ausschließlich die Transkripte von SAP2, SAP8, SAP9 und SAP10 konnten im Medium ohne Proteinzusatz zu allen untersuchten Zeitpunkten nachgewiesen werden. Verschiedene Medien zur Induktion der Myzelausbildung wirkten sich unterschiedlich auf die Expression der SAP-Gene aus. Im Gegensatz zu definierten Induktionsmedien konnten bei der Gegenwart von Serum keine SAP1-, SAP2- und SAP3-Transkripte nachgewiesen werden, was auf eine hemmende Wirkung einiger Serumkomponenten auf die Expression dieser Gene bzw. auf eine differenzierte Expression der SAPs in verschiedenen Nischen im Wirtsorganismus hindeuten kann. Die myzelspezifischen Gene SAP4 und SAP6 waren in beiden myzelinduzierenden Medien gegenläufig exprimiert: die Transkription von SAP6 war in definierten und von SAP4 in serumhaltigen Medien am stärksten. Beim phänotypischen Wechsel des Stammes WO-I war die Expression der SAP-Gene allgemein, vor allem aber von SAP1, SAP3, SAP6 und SAP8, in der "opaque" Form stärker als in der "white" Form. Bei der Analyse der SAP-Expression im Oesophagus oral infizierter DBA/2- und Balb/c-Mäusen wurde eine direkte Korrelation zwischen der Abwehrstärke des Wirtsorganismus und der SAP- Expression festgestellt. Die Defizienz von DBA/2-Mäusen für den Komplementfaktor C5 bewirkte im Vergleich zu Balb/c-Mäusen eine stärkere Proliferation von Candida-Zellen und die verstärkte Expression der Gene SAP2, SAP3, SAP8 und SAP10. Transkripte von SAP4-6 und SAP9 wurden in den meisten untersuchten Oesophagusproben von beiden Mäuse-Stämmen nachgewiesen. Die Untersuchung der Expression der SAP-Gene im zeitlichen Verlauf während einer intra peritonealen (i. p.) Infektion im Mausmodell zeigte die Expression von SAP2 und SAP4-6 in allen untersuchten Organen nach 4, 8, 24 und 72 Stunden. Die Transkripte von SAP3 und SAP10 wurden deutlich zum Zeitpunkt der Invasion von C. albicans in die Leber (8 Stunden) aber weder in späteren Infektionsstadien in der Leber (72 Stunden) noch in den sekundär infizierten Nieren nachgewiesen. In keinem der untersuchten Organe wurden SAP7-Transkripte nachgewiesen. Diese Versuche bestätigen die Beteiligung der Gene SAP4-6 bei der Invasion von C. albicans. Ein in dieser Arbeit hergestelltes Plasmid zur Retransformation einer Dsap6-Mutante trug weiterhin dazu bei zu beweisen, dass vor allem SAP6 für Invasionen notwendig ist (FELK et al., angereicht). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Expression der myzelspezifischen Gene SAP4-6 wahrscheinlich über die MAP-Kinase- und cAMP-Kaskaden reguliert wird. Die gleichzeitige Deletion der Transkriptionsfaktoren Efg1p und Cph1p, welche zur Inaktivierung beider Kaskaden führt und als Folge die Myzeldefizienz von C. albicans hervorruft, reduzierte stark die Expression von SAP5 und SAP6 im FCS-Medium in vitro. Bei der i. p. Mausinfektion war die Inhibition der Genexpression der SAP4-6 in den Defg1-, Dcph1-Einzelmutanten und Defg1 / Dcph1-Doppelmutante weniger ausgeprägt, als in vitro. Transkripte von SAP1 und SAP3 konnten in der Dcph1-Einzelmutante und von SAP8 in der Defg1-Einzelmutante im i. p. Mausmodell nach 24 h Infektion nicht nachgewiesen werden. Die beobachteten Veränderungen im Expressionsprofil der SAP-Gene in diesen Mutanten deuten darauf hin, dass sich hier nicht nur die Myzeldefizienz alleine, sondern auch andere Faktoren, wie die Aspartat-Proteasen, auf die Virulenz von C. albicans auswirken. Diese Ergebnissen bestätigen das Postulat über den simultanen Beitrag mehrerer Attribute des Pilzes zur Virulenz (CUTLER, 1991, ODDS, 1994b). In dieser Arbeit wurde das SAP10-Gen vollständig sequenziert und auf Grund der hohen Homologie zu SAP9 der SAP-Genfamilie zugeordnet. Die Proteinsequenz beider Proteasen lässt vermuten, das es sich nicht um sekretorische, sondern vermutlich durch GPI-Anker mit der Zellwand oder Plasmamembran verbundene Proteine handelt. Für eine Funktionsanalyse von SAP9 und SAP10 wurden diese Gene ausgeschaltet, die entsprechenden Mutanten charakterisiert und die Proteine untersucht. Die hergestellten Mutanten hatten eine reduzierte Fähigkeit Myzel auszubilden und waren leicht gegenüber osmotischem Schock empfindlich. Die maximale Aktivität von Sap9p und Sap10p wurden bei pH 2,3 und 4,5 gemessen. Eine hohe Homologie zu den prozessierenden Proteasen Yps1p und Yps2p von Saccharomyces cerevisiae und die nur geringfügige Hydrolyse von Serumalbumin durch Sap9p und Sap10p deuten ebenfalls auf eine prozessierende Funktion der beiden Proteasen hin. Es konnte außerdem durch Southern-Blot-Analyse gezeigt werden, dass auch bei nicht proteolytischen Candida Spezies ähnliche Gene existieren. Jedoch bleibt die genaue Funktion von Sap9p und Sap10p unklar und bedarf weitere Untersuchungen.The incidence of life-threatening mycoses has dramatically increased in recent years. Among other human pathogenic fungi, Candida albicans belongs to those fungi which most commonly cause mycoses. C. albicans is an opportunistic pathogen which is harmless to healthy individuals and is part of the normal microbial flora of skin and mucosa. Only under certain circumstances, such as when the immune system is impaired or after administration of broad-spectrum antibiotics, do deep-seated or systemic infections with C. albicans occur. A major part of the research on C. albicans is focussed on those virulence factors that enable the fungus to penetrate into the host. The secreted aspartate proteases are one of the most discussed virulence factors of C. albicans. They can digest host proteins and may therefore help the fungus to invade host tissue. C. albicans possesses a large gene family (SAPs) with ten members encoding the secreted aspartate proteases (Saps) which may be differentially activated during infection. The different members of this gene family were identified within the last decade and no systematic research analysing all ten genes has been performed so far. The initial objective of this thesis was to analyse the expression profiles of all ten SAP genes under different growth conditions in vitro. Thereafter, studies were extended to investigate in vivo (SAP) expression during oral and intra-peritoneal (i. p.) infections of mice. The second objective of this thesis was to describe and characterise the genes SAP9 and SAP10 and the proteolytic properties of the corresponding proteases. The conditions chosen for the in vitro expression analysis were hyphal induction, growth in media containing protein or ammonium sulfate as a sole source of nitrogen, and phenotypic switching. The SAP gene expression pattern was investigated using RT-PCR. The highest level of transcription for all the SAP genes was detected in minimal media supplemented with protein, which is known to induce protease activity of C. albicans. In contrast, a general down-regulation of SAPs was observed in the absence of protein in minimal medium with ammonium sulfate as the sole source of nitrogen. Only the transcripts of SAP2, SAP8, SAP9 and SAP10 could be detected at all time points in this protein-lacking medium. Different media that induced hyphal production had different influences on the expression of SAPs. In contrast to hyphal induction in defined media, no transcripts for SAP1, SAP2 and SAP3 were observed in the presence of serum, suggesting that serum compounds may have inhibited the expression of these genes and that SAPs may be differentially expressed in different niches of the host. The hyphal specific genes SAP4 and SAP6 were shown to have contrasting expression profiles in both media. The strongest transcription of SAP6 was detected in defined media, while SAP4 was most strongly expressed in serum-containing media. During phenotypic switching of C. albicans strain WO-1, the expression of SAP genes in the ?opaque? form was generally stronger. Particularly, SAP1, SAP3, SAP6 and SAP8 transcripts were expressed at their highest level in this switching form as compared with the ?white? form. SAP expression analysis in the oesophagus of orally infected DBA/2 and Balb/c mice, indicated a direct correlation between the defence capacity of the host and the expression of SAP genes. In the complement factor C5-deficient DBA/2 mice, Candida cells showed stronger proliferation and expressed SAP2, SAP3, SAP8 and SAP10 at high levels. Transcription of SAP4-6 and SAP9 was detected in most infected oesophagus samples of both mice strains. The kinetics of SAP expression during intra-peritoneal infections (i. p.) of mice was analysed in infected livers at 4, 8, 24, and 72 h post infection and in infected kidneys 72 h after initiation of the infection. In all investigated organs, SAP2 and SAP4-6 transcripts were detected. The transcripts for SAP3 and SAP10 were mostly detected at the time point of C. albicans invasion into the liver (8 h), but not at later stages of liver infection (72 h) or in secondary infected kidneys. Transcripts of SAP7 were never detected. These results confirm the contribution of SAP4-6 during C. albicans invasion. A plasmid constructed in this thesis, designed to retransform a Dsap6 mutant, was used to further demonstrate that SAP6 in particular is required for invasion (Felk et al., submitted). Furthermore, it could be shown that expression of the hyphal- specific genes SAP4-6 is likely to be regulated via the MAP-kinase and cAMP cascades. The inactivation of both cascades by deletion of the transcriptional factors Efg1p and Cph1p, which causes a deficiency in C. albicans hyphal transformation, strongly reduced the expression of SAP5 and SAP6 in serum containing medium in vitro. During i. p. mice infections with Defg1, Dcph1 and Defg1 / Dcph1 mutants of C. albicans, the inhibition of SAP4-6 expression was less significant in comparison with the wild type strain. Twenty-four hours after infection no transcripts for SAP1 or SAP3 were found in the Dcph1 mutant, and no SAP8 transcripts were detected in the Defg1 mutant. This indicates that not only hyphal deficiency, but also the lack of other factors, such as secreted aspartate proteases, may influence the virulence properties of these mutants. These results verify the postulation that the simultaneous expression of several virulence attributes contribute to the virulence of C. albicans (CUTLER, 1991, ODDS, 1994b). The SAP10 gene was sequenced in this thesis. Due to the high homology to SAP9, SAP10 was assigned as a member of the SAP gene family. The protein sequences of both Sap9p and Sap10p contain GPI attachment sequences, which indicate that both proteins may possibly localise either in the plasma membrane or in the cell wall. To functionally analyse SAP9 and SAP10, the genes were disrupted and the corresponding mutants were characterised. The Dsap9 and Dsap10 single mutants had a reduced ability to form hyphae and showed a moderate osmotic sensitivity during growth on hyperosmotic media. The optimal proteolytic activity of Sap9p and Sap10p was determined to be pH 2.3 and 4.5, respectively. The high homologies of Sap9p and Sap10p to the processing proteases Yps1p and Yps2p of S. cerevisiae and the reduced ability of Sap9p and Sap10p to hydrolyse serum albumin, also indicate a processing function for both proteinases. Furthermore, using Southern analysis, it could be shown that similar genes also exist in non- proteolytic Candida species. However, the precise functions of Sap9p and Sap10p are still unknown and further investigations are required