Aufklärung grundlegender Aminosäuresynthesewege von Streptococcus pneumoniae mittels Isotopolog Profiling und Einfluss des Glutaminmangels auf die bakterielle Virulenz

Als Mitglieder der Ordnung Lactobacillales ist das Hauptkatabolit der Pneumokokken sowohl unter aerober wie auch microaerophiler Atmosphäre Lactat. Des Weiteren synthetisiert S. pneumoniae eine große Bandbreite an ABC-Transportersystemen, die an der Assimilation und an dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, löslichen Verbindungen und Aminosäuren beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde der Kohlenstoffmetabolismus mittels 13C-Isotopologen Verteilung nach Wachstum der Pneumokokkenkultur in chemisch definiertem Medium (CDM) mit [U-13C6]Glucose, [1,2-13C2]Glucose oder [U-13C2]Glycin analysiert. GC/MS-Analysen zeigten ein Muster an schwer-markierten und unmarkierten Kohlenstoffatomen in den Aminosäuren. Die Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass Pneumokokken sowohl einzelne Aminosäuren aufnehmen, wie auch über klassische oder nicht-klassische Biosynthesewege de novo synthetisieren können. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro und Gly blieben im Isotopolog Profiling unmarkiert, was ein Hinweis auf das Fehlen von Biosynthesewegen oder ihrer Regulation unter bestimmten Umweltbedingungen sein könnte. Obwohl die genetische Information für die Biosynthese der essentiellen verzweigtkettigen Aminosäuren (BAA; Ile, Leu und Val) in S. pneumoniae vorhanden ist, ergaben die 13C-Markierungsversuche keine de novo Synthese. Jedoch konnte durch Langzeit-1H-NMR (LT-NMR) Analysen eine aktive Aufnahme dieser Aminosäuren nachgewiesen werden. Darüber hinaus wird Aspartat nicht über den allgemeinen Stoffwechselweg mit Pyruvat und Acetyl-CoA synthetisiert. Die Aspartat-Synthese erfolgt im ersten Schritt durch die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und CO2 zu Oxalacetat. Im zweiten Schritt wird Oxalacetat dann in Aspartat mit der Nebenreaktion Glutamat zu alpha-Ketoglutarat durch die Aspartat-Transaminase metabolisiert. GC/MS Analysen ergaben weiterhin, dass komplett markierte aromatische Aminosäuren aus Erythrose-4-Phosphat und zwei Molekülen PEP über das Intermediat Chorismat synthetisiert wurden. Es zeigte sich außerdem, dass [M+1] markiertes Serin durch die Hydroxymethylierung von unmarkiertem Glycin über 5,10-Methylentetrahydrofolat als Teil des C1-Pools hergestellt wurde. Weiterhin wurden In LT-NMR-Untersuchungen Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metabolite quantifizert. Die homofermentative Milchsäuregärung konnte in Pneumokokken durch einen extrazellulären Anstieg der Lactatkonzentration nachgewiesen werden. Als essentielle Kandidaten wurden Glutamin und Uracil identifiziert, die das Pneumokokkenwachstum bei Mangel einschränken. Diese Ergebnisse zeigen die Vielzahl von Aminosäuren-Synthesewegen in Pneumkokken und die notwendige Rolle der Transportersysteme in Pneumokokken für die bakterielle Fitness und für die Adaption an verschiedene Wirtsnischen. Sechs mögliche Glutamin-Aufnahmesysteme konnten durch Genomanalysen von Streptococcus pneumoniae Stämmen identifiziert werden. Die Reverse Transkriptions-PCR haben gezeigt, dass die sechs gln-Operons unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Vier der gln-Gencluster bestehen aus den Genen glnQPH, während in zwei Regionen das Gen glnH, welches für eine lösliche Glutamin-Bindungsdomäne kodiert, fehlt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss zwei dieser Glutamin-ABC-Transporter, mit den Operons glnQPH0411/0412 und glnQPH1098/1099, in S. pneumoniae D39 auf Virulenz und Phagozytose untersucht. Die zwei charakterisierten Transportersysteme bestehen jeweils aus der ATPase GlnQ und einem translatorischem Fusionsprotein aus der Permease GlnP und dem Bindungsprotein GlnH. Für die Untersuchungen wurden diese beiden Transporter mittels Insertations-Deletions-Mutagenese inaktiviert. CD-1 Mäuse, die intranasal mit biolumineszierenden D39delgln0411/0412 infiziert wurden, zeigten in Echtzeit eine signifikant erhöhte Überlebenszeit und eine Attenuierung bei der Ausprägung einer Pneumonie im Vergleich zu biolumineszierenden Wildtyp D39 Pneumokokken. Im murinen Sepsismodell mit der D39delgln0411/0412-Mutante zeigte sich eine gemäßigte, aber signifikante Abschwächung der Pathogenese. Im Gegensatz dazu war die D39delgln1098/1099 Mutante sowohl im murinen Pneumonie- wie auch Sepsismodell massiv attenuiert. Es war eine 100- bis 10000- fach höhere Infektionsdosis erforderlich, um mit der D39delgln1098/1099-Mutante eine vergleichbare Pathogenese der Pneumonie oder Sepsis wie beim Wildtypstamm D39 hervorzurufen. Im experimentellen Meningitismodell zeigten sich bei der D39delgln1098/1099-Mutante eine erniedrigte Anzahl an Leukozyten im Liquor und ein reduzierter Bakterientiter im Blut im Vergleich zu D39 und D39delgln0411/0412. Auch die Phagozytose-Experimente bestätigten eine signifikante verminderte Überlebensrate der beiden gln-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae D39, was auf den Einfluss der bakteriellen Fitness auf den Schutz gegen oxidativen Stress hinweist. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass beide Glutamin-Aufnahmesysteme für die vollständige Virulenz der Pneumokokken essentiell sind, aber verschiedene Auswirkungen auf die Pathogenese der Bakterien unter in vivo Bedingungen haben. Das Zelloberflächenprotein PavA der Pneumokokken ist ein Virulenzfaktor, der für invasive Erkrankungen wichtig ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PavA essentiell für die in vivo Besiedlung von Streptococcus pneumoniae D39 in den oberen Atemwegen von Mäusen ist. In dem murinen Pneumoniemodell wurden pavA-Mutanten nicht aus den infizierten Mauslungen eliminiert, sondern persistierten und lösten somit eine chronische Infektion aus, während Wildtyp-Pneumokokken systemische Erkrankungen verursachten. PavA-defiziente Pneumokokken konnten unter experimentellen Bedingungen nicht aus der Lunge in die Blutbahn streuen. Diese Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass PavA an der erfolgreichen Kolonisation der Schleimhautoberflächen und an der Translokation der Pneumokokken durch Wirtsbarrieren beteiligt ist.Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are human pathogens, which are able to pass the host nasopharyngeal barriers and cause severe diseases such as pneumonia, meningitis and septicemia. As pneumococci are members of the order of lactobacillales, the major catabolite of carbohydrate metabolism under aerobe and microaerophilic atmosphere is lactate. However S. pneumoniae synthesizes also a large fraction of ABC transporter systems involved in uptake and metabolism of carbohydrates, soluble compounds and amino acids. Here we started to analyze carbon metabolism by 13C isotopologue perturbation after growth of pneumococci in chemically defined media (CDM) in the presence of [U-13C6]glucose or [1,2-13C2]glucose as the sole C-source. GC/MS analysis showed a pattern of labeled and non labeled amino acids. The results suggest that pneumococci take up specific amino acids, while others are synthesized de novo by classical or non-classical biosynthesis pathways. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro and Gly remain unlabeled, which is a hint for the lack of de novo synthesis pathways or their regulation under certain environmental conditions. Strikingly, the data for the essential branched amino acids (BAA; Ile, Leu and Val) are unexpected, as genes encoding enzymes required for the synthesis were annotated (http://www.genome.jp/kegg/). Moreover, Asp is not synthesized via the general pathway including pyruvate and acetyl-CoA but by conversion of phosphoenolpyruvate (PEP) and CO2 to oxaloacetate catalyzed by the PEP carboxylase. Oxaloacetate is then converted into alpha-ketoglutarate with the lateral conversion reaction glutamate to aspartate by the aspartate transaminase. GC/MS analysis further showed that complete labeled aromatic amino acids are synthesized from erythrose-4-phosphate and two molecules of PEP via the intermediate chorismate. Finally, unlabeled Gly is not synthesized out of one labeled Ser. In pneumococci, Ser is probably synthesized by hydroxymethylation from 5,10-methylenetetrahydrofolate as part of the one carbon pool. The changes in extracellular metabolites were quantified by using long-time 1H-NMR experiments (LT-NMR). Pneumococci are lactic acid bacteria and hence, lactic acid increased when glucose was used as the sole carbon source. Moreover, candidates for the observed nutritional limitations were identified such as glutamine and uracil, which both are essential for pneumococcal growth. All these data show for the first time the variety of amino acid synthesis pathway in pneumococci and the essential role of pneumococcal amino acid transporter systems for bacterial fitness und host milieu adaptation. The genomic analysis of Streptococcus pneumoniae predicted six putative glutamine uptake systems, which are expressed under in vitro conditions as shown here by reverse transcription PCR. Four of these operons consist of glnHPQ, while two lack glnH, encoding a soluble glutamine binding protein. It was analyzed the impact of two of these glutamine ABC transporters, namely glnQPH0411/0412 and glnQPH1098/1099, on S. pneumoniae D39 virulence and phagocytosis. Both transporters consist of GlnQ, and a translationally fused protein of GlnH and GlnP. Mice infected intranasally with D39delgln0411/0412 showed significant increased survival times and a significant delay in the development of pneumococcal pneumonia compared to D39 as observed in real-time using bioluminescent pneumococci. In a mouse sepsis model the mutant D39delgln0411/0412 showed only a moderate but significant attenuation. In contrast, the D39delgln1098/1099 knockout strain was massively attenuated in the pneumonia and septicemia mouse infection model. To cause pneumonia or sepsis with D39delgln1098/1099 100- to 10.000 fold higher infection doses were required compared to those used for wildtype strain D39. In the experimental mouse meningitis model, D39delgln1098/1099 showed decreased levels of white blood cells in cerebrospinal fluids and also decreased numbers of bacteria in bloodstream compared to D39 and D39delgln0411/0412. Phagocytosis experiments revealed significantly decreased intracellular survival rates of mutants D39delgln1098/1099 and D39delgln0411/0412 compared to wild-type D39, suggesting that the deficiency of Gln uptake systems impairs resistance against oxidative stress. Taken together our results demonstrate that both glutamine uptake systems are required for full virulence of pneumococci but exhibiting a different impact on pathogenesis of pneumococci under in vivo conditions. The pneumococcal cell surface protein PavA is a virulence factor associated with adherence and invasion in vitro. In this study we show in vivo that PavA is necessary for Streptococcus pneumoniae D39 colonization of the murine upper respiratory tract in a longterm carriage model, with PavA-deficient pneumococci being quickly cleared from nasopharyngeal tissue. In a pneumonia model, pavA mutants were not cleared from the lungs of infected mice and persisted to cause chronic infection, whereas wild-type pneumococci caused systemic infection. Hence, under the experimental conditions, PavA-deficient pneumococci appeared to be unable to seed from lung tissue into blood, although they survived in blood when administered intravenously. Taken collectively these results suggest that PavA is involved in successful colonization of mukosal surfaces and in translocation of pneumococci across host barriers. Pneumococcal sepsis is a major cause of mortality worldwide so identification of factors such as PavA those are necessary for carriage and for translocation from tissue to blood is of clinical and therapeutic importance