In silico Studien Viraler Proteine: Struktur, Design, und Dynamik

Viruses still represent a serious health issue today, even in developed countries. Control of virus-related diseases relies on vaccination and/ or medication focussing on specifically interfering with the viral life cycle to minimize adverse effects in the patient. Both, vaccination and medical treatment benefit from detailed knowledge about the structure of viral proteins. Beyond static structural aspects, in many cases a molecular mechanistic understanding of viral protein functions proves crucial. However, atomistic studies of protein structure and dynamics with experimental methods are frequently very difficult. Therefore, computer aided methods represent a powerful supplemental approach, exemplified in the three topics studied in this work. Molecular dynamics (MD) simulations and computational analyses were used to enhance understanding of the correlation between sequence, structure, and dynamics of retroviral proteases and its impact on ligand binding and function. For the identification of the binding sites of neutralizing antibodies directed against human cytomegalovirus (HCMV) structural information was generated by static structure modelling. A dynamic picture of the conformational changes occurring in class III viral fusion proteins was obtained by MD studies of vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSV‐G). The two retroviruses human T‐lymphotropic virus type I (HTLV‐I) and human immunodeficiency virus type 1 (HIV‐1) are the causative agents of severe and fatal diseases including adult T‐cell leukemia and the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Both viruses code for a protease that is essential for replication and therefore represents a key drug target. The retroviral proteases of HIV‐1 and HTLV‐I share 31% sequence identity and high structural similarities. Yet, their substrate specificities and inhibition profiles differ substantially. In this study, all‐atom MD simulations were performed for both enzymes in their ligand‐free state and in complex with model substrates in order to compare their dynamic behaviour. Extensive similarities were found in both local and overall protein dynamics, as well as in the energetics of the interactions with model substrates. Interestingly, those residues important for a strong ligand binding are frequently not conserved in sequence, thereby offering an explanation for the differences in binding specificity. Moreover, an interaction network of contacts between conserved residues was identified that interconnects secondary structure elements and serves as a scaffold for the protein fold. This interaction network is conformationally stable over time and may provide an explanation for the highly similar dynamic behaviour of the two retroviral proteases even in the light of their rather low overall sequence identity. Human cytomegalovirus (HCMV), a member of the herpesvirus family represents a serious health threat for infants and immunocompromised individuals, even in developed countries. Therefore, development of a potent HCMV immunization has been rated top priority by Institute of Medicine of the National Academy of Sciences, USA. In a joint research project with two groups from the Departments of Virology and Molecular Medicine in Erlangen, new neutralizing antibodies directed against the HCMV fusion mediator glycoprotein B (gB) were identified. For their characterization, a set of computational methods was developed in this work to render experimental epitope mapping more efficient. In a first step, structural information about HCMV gB was obtained by modelling the trimeric HCMV gB protein in two alternative conformations. The postfusion model was generated by homology modelling based on the crystal structure of herpes simplex virus (HSV) gB, the prefusion model was created using an alternative modelling approach based on the prefusion structure of vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSV‐G). Subsequent engineering of constructs for the isolated expression of discontinuous individual gB domains helped to narrow the binding regions. For epitope fine mapping, candidate residues for a di‐alanine‐screening procedure were identified using structural information, such as side chain surface exposition and spatial arrangement, from the previously generated structure models. Where exact epitope required the insertion of multiple alanine mutations, MD simulations were used to assess the conformational stability of the mutant proteins. The usefulness of applying this set of computational methods was demonstrated by the success in mapping the specific epitopes of the majority of tested antibodies. The computer based methods presented in this present study therefore helped to close the gap of knowledge on HCMV gB structural properties and to take the development of HCMV immunization one step further. A third aspect of the present work focused on gaining molecular mechanistic insight into the structural rearrangement of viral fusion proteins involved in the entry process. Herpesviral gB belongs to new class of fusion proteins (class III) which is presently poorly understood. Vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSV‐G) also belongs to this class of fusion proteins. Since the structure of VSV‐G has been solved in two different conformations, and fusion is known to be triggered by low pH, VSV‐G was chosen as a model system to investigate class III fusion mechanisms. To this end, molecular dynamics simulations were performed of the VSV‐G prefusion structure in two different protonation states: at physiological pH (pH7) and low pH in the endosome (pH5). Indeed, specific differences in domain motions could be shown for the pH5 system. Domain IV containing the fusion loops, which need to interact with the target membrane, showed distinctly altered conformational sampling compared to the pH7 system. This finding was further supported by energetic analyses revealing weakened interaction between domain IV and the protein core at pH5. Two pairs of structurally neighbouring conserved and differentially protonated residues in the domain IV‐core interface were identified as the likely triggers for domain IV motions. Energetic calculations also demonstrated that the interaction between the subunits of the trimeric VSV‐G in strengthened at pH5, mainly due to an increased number of interactions between the C‐terminal loop of domain II and the N‐terminus of the adjacent subunit. A pair of interacting residues in this interface that is affected by protonation could be shown to be the main effectors of this phenomenon. The results of the present study thus enhance the mechanistic understanding of the initial steps of pH dependent fusion.Viren stellen auch heute noch eine ernsthafte Gesundheitsbedrohung dar, sogar in den westlichen Industrieländern. Zur Kontrolle von Viruserkrankungen werden Impf‐ oder Therapieverfahren eingesetzt, die spezifisch die Funktion viraler Proteine – und damit den Replikationszyklus der Viren – hemmen, um dadurch Nebenwirkungen für den Patienten zu minimieren. Für die Entwicklung von Immunisierungs‐ und Behandlungsmethoden ist daher detaillierte Kenntnis der Struktur viraler Proteine von großem Vorteil. Darüber hinaus ist häufig auch ein molekular‐mechanistisches Verständnis viraler Proteinfunktionen unerlässlich. Die experimentelle Untersuchung von Proteinstrukturen und deren Dynamik auf atomarer Ebene gestaltet sich jedoch mitunter noch äußerst schwierig. Computergestützte Methoden stellen daher einen praktikablen und sinnvollen Ansatz dar um diese Lücke zu schließen, wie anhand der drei thematischen Schwerpunkte dieser Arbeit gezeigt wird. Moleküldynamik‐Simulationen und in silico Analysen wurden hier genutzt, um das Zusammenspiel zwischen Sequenz, Struktur und Dynamik retroviraler Proteasen und dessen Einfluss auf die Ligandenbindung und Proteinfunktion zu untersuchen. Für die Bestimmung der Bindungsepitope neutralisierender Antikörper gegen das Humane Cytomegalievirus (HCMV) konnten mithilfe statischer Strukturmodellierung wertvolle Informationen gewonnen werden. Darüber hinaus konnte in Moleküldynamik‐Studien von Glykoprotein G des vesikulären Stomatitisvirus (VSV‐G) ein dynamisches Bild der Konformationsänderung von Klasse III Fusionsproteinen erhalten werden. Das Humane T‐lymphotrope Virus Typ I (HTLV‐I) und das Humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV‐1) aus der Familie der Retroviren verursachen schwerste und zum Teil tödliche Erkrankungen wie T‐Zell Leukämie und das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS). Beide Viren kodieren in ihrem Genom eine für die Replikation essentielle Protease, die eine wichtige Zielstruktur für die pharmakologische Therapie darstellt. Die viralen Proteasen von HIV‐1 und HTLV‐I sind zu 31% sequenzidentisch und zeigen große strukturelle Ähnlichkeiten. Allerdings unterscheiden sich ihre Substratspezifitäten und Inhibitionsprofile deutlich. In dieser Studie wurden Moleküldynamik‐Simulationen beider Enzyme, jeweils im ungebundenen Stadium und im Komplex mit einem Modellsubstrat, durchgeführt um ihre dynamischen Eigenschaften zu vergleichen. Dabei wurden erhebliche Ähnlichkeiten in Bezug auf lokale und globale Dynamik, sowie die Interaktionsenergetik mit den Modellsubstraten festgestellt. Interessanterweise sind die Aminosäurereste, die eine starke Interaktion mit dem Substrat vermitteln, zum großen Teil nicht konserviert. Diese Beobachtung bietet eine Erklärung für die unterschiedlichen Ligandenspezifitäten der beiden Enzyme. Darüber hinaus wurde ein Interaktionsnetzwerk, bestehend aus Kontakten zwischen konservierten Resten, identifiziert, das Sekundärstrukturelemente miteinander verbindet und als eine Art Gerüst für die Proteinstruktur dient. Die konformationelle Stabilität dieses Interaktionsnetzwerks stellt eine mögliche Erklärung dafür dar, warum die beiden Proteasen trotz ihrer vergleichsweise geringen Sequenzidentität in ihren dynamischen Eigenschaften so ausgeprägte Analogien aufweisen. Das Humane Cytomegalievirus (HCMV), ein Herpesvirus, stellt besonders für Neugeborene und Immungeschwächte auch in Industrieländern ein schwerwiegendes Gesundheitsrisiko dar. Daher wurde die Entwicklung einer wirksamen Immunisierungsmethode für HCMV von der vom Medizinischen Institut der amerikanischen National Academy of Science zur obersten Priorität erklärt. In einem gemeinsamen Forschungsprojekt mit zwei Arbeitsgruppen aus den Instituten für Virologie und Molekulare Medizin der Universität Erlangen wurden neue neutralisierende Antikörper gegen das HCMV Membranfusionsprotein Glykoprotein B (HCMV gB) identifiziert. Für deren Charakterisierung wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Abfolge von in silico Methoden etabliert, um den Prozess der experimentellen Epitop‐Kartierung effizienter zu gestalten. Im ersten Schritt wurden durch Molekülmodellierung zwei alternative Konformationen des trimeren gB‐Proteins generiert, wie sie vor und nach der Membranfusion auftreten (Prä‐ und Postfusions‐Struktur). Das Modell der Postfusions‐ Konformation wurde auf Grundlage der Kristallstruktur von Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV) gB mithilfe von Homologie‐Modellierung erstellt. Das Präfusions‐Modell wurde mit einer alternativen Modellierungsmethode basierend auf der Präfusions‐Struktur von Glykoprotein G des vesikulären Stomatitisvirus (VSV‐G) generiert. Darauf aufbauend wurden mit Computermethoden Expressionskonstrukte für die isolierte Expression einzelner, zum Teil diskontinuierlicher, Domänen von gB entworfen, mit deren Hilfe die Binderegionen der Antikörper im Experiment eingegrenzt werden konnten. Für die anschließende Feinkartierung der Epitope wurden Kandidatenreste für einen Di‐Alanin‐Scan bestimmt. Aus den vorher erstellten Modellen konnten dafür strukturelle Daten, wie Oberflächenexposition der Seitenketten und deren relative Lage, genutzt werden. In Einzelfällen, wo die genaue Bestimmung des Epitops mehrere Alanin‐Mutationen erforderte, wurde mithilfe von Moleküldynamik‐Simulationen die konformationelle Stabilität der Expressionsmutanten untersucht. Der Nutzen von Computer‐basierten Methoden bei der Antikörper‐Charakterisierung wurde dadurch bestätigt, dass die Epitope der meisten getesteten Antikörper experimentell bestimmt werden konnten. Somit konnte die in dieser Arbeit entwickelte Vorgehensweise dazu beitragen neue Erkenntnisse über die strukturellen Eigenschaften von HCMV gB zu gewinnen und die Entwicklung einer HCMV‐Immunisierung voranzutreiben. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist die molekular‐mechanistische Untersuchung des Umlagerungsprozesses viraler Fusionsproteine während der Verschmelzung von Virusmembran und Zellmembran, die das Eindringen des Virus in die Wirtszelle ermöglicht. Das herpesvirale Glykoprotein B gehört ebenso wie Glykoprotein G des vesikulären Stomatitisvirus (VSV‐G) zu einer neuen Klasse von Fusionsproteinen (Klasse III), über die derzeit noch wenig bekannt ist. Da von VSV‐G sowohl die Prä‐ als auch die Postfusions‐Struktur experimentell bestimmt wurden, und bekannt ist, dass die Umlagerung pH‐abhängig ist, wurde VSV‐G als Modellsystem gewählt, um den Fusionsmechanismus von Klasse III Proteinen zu untersuchen. Dazu wurden Moleküldynamik‐ Simulationen der Präfusions‐Struktur von VSV‐G in zwei verschiedenen Protonierungszuständen durchgeführt: bei physiologischem pH7 und bei pH5, entsprechend dem niedrigen endosomalen pH. In den Simulationen zeigten sich bei pH5 spezifische Unterschiede in Domänenbewegungen von Domäne IV, in der sich die Fusions‐Loops befinden, die mit der Zielmembran interagieren um die Membranfusion zu induzieren. Domäne IV wies bei niedrigem pH im Vergleich zum pH7‐System eine deutlich veränderte Vorzugsorientierung auf. Diese Beobachtung wurde durch energetische Analysen bestätigt, die eine Schwächung der Interaktion zwischen Domäne IV und dem Kernbereich des Proteins erkennen ließen. Als wahrscheinliche Ursache für diese Unterschiede konnte die differentielle Protonierung von zwei Paaren konservierter interagierender Reste in der entsprechenden Proteinkontaktfläche identifiziert werden. Diese Reste gelten somit als wahrscheinliche Auslöser der pH‐induzierten Domänenbewegung. Darüber hinaus zeigten energetische Berechungen bei pH5 stärkere Interaktionsenergien zwischen den einzelnen Untereinheiten des trimeren VSV‐G. Dieser Effekt lässt sich hauptsächlich auf eine höhere Zahl an molekularen Kontakten zwischen der C-terminalen Schleife von Domäne II und dem N‐Terminus der jeweils angrenzenden Untereinheit zurückführen. Auch in dieser Kontaktfläche befindet sich ein Paar interagierender Reste mit differenziell protonierter Seitenkette, das wahrscheinlich maßgeblich die Stärkung der Trimer‐ Interaktionen verursacht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen tragen insgesamt zu einem neuen Verständnis der initialen Schritte der pH‐abhängigen Fusion in Klasse III Protein bei