Detektion Molekularer und Spurenelementarer Änderungen im Scrapie-infizierten Nervengewebe während der Pathogenese

Title and Contents 1\. Introduction 1 2\. Materials and Methods 39 3\. Results 63 4\. Discussion 99 5\. Conclusions 121 6\. Abstract 125 7\. Zusammenfassung 129 8\. References 133 List of Abbreviations 159 List of Publications 161 Acknowledgements 163Scrapie is a neurodegenerative disease that is characterized by the accumulation of the misfolded prion protein, PrPSc, which carries the infectivity. The function of the normal prion protein is still unclear; however, it has been shown to bind copper and may play a role in copper homeostasis, which may also be involved in the neurotoxicity of the disease. To date, the majority of studies on prion protein infection have been performed on terminally ill animals so the molecular events underlying the disease, especially at early stages, are still poorly understood. Thus, the main goal of the thesis was to examine the chemical composition of scrapie infected nervous tissue at pre-clinical time points in order to investigate prion-induced molecular differences. To address the compositional changes associated with scrapie infection, a time-course study was used. 263K scrapie- infected (N=24) and mock-infected (control, N=15) hamsters sacrificed at five time points: 70 days post infection (dpi), 100 dpi, 130 dpi, first clinical signs (~145 dpi), and terminally diseased (~180 dpi) were studied. Protein composition, structure, and distribution were examined in the dorsal root ganglia (DRG) with 3F4 immunostaining and synchrotron Fourier Transform InfraRed Microspectroscopy (FTIRM). Trace metal content and distribution was determined from serial sections of the same DRG using synchrotron x-ray fluorescence (SXRF) microprobe. Results showed that protein-related changes occur at the pre-clinical stages of scrapie, before the transformation of PrPC to PrPSc. The scrapie-infected animals exhibited a significant increase in protein expression, yet the β-sheet protein content was significantly lower than controls. Regions of elevated β-sheet content were observed only at the plasmalemma and in surrounding satellite cells. Then, over the course of the disease, the β-sheet content increased significantly, leading to higher numbers of terminally diseased animals. Comparison with the same tissue, subsequently immunostained for PrP, proved that this increase in ß-sheet is at least partly related to increasing amounts of PrPSc. Thus, the spectral findings are likely to be specific for prion diseases such as scrapie. At the terminal stage of the disease, the relative protein expression declined significantly, likely due to the induced neuronal death. Moreover, there was a strong inverse correlation between the distribution of α\- helical and β-sheet protein content (R2 = -0.636), where cells exhibiting very high β\- sheet content had a very low α-helical content a correlation that was much lower in earlier stages of the disease. Based on these findings, we suggest that the preclinical stages of scrapie are characterized by an overexpression of proteins low in β-sheet content. As the disease progresses, PrPC is converted to PrPSc, along with the conversion or replacement of other α-helical-rich proteins by β-sheet rich proteins. The dramatic changes in protein content and structure at pre-clinical time points emphasizes the need for identifying protein alterations involved in early pathogenesis, which are important for understanding the disease and may provide a mechanism for early TSE diagnosis and treatment. Furthermore, 70 dpi infected brains examined with the aid of synchrotron light showed significant alterations in the spectral fingerprint region, as calculated by the ratio of the symmetric and asymmetric P=O stretching in >PO2-, indicating changes in nucleic acids, carbohydrates or phospholipids at very early stages of the disease. Furthermore, some of the investigated animals exhibited a lower content of β-sheet and slightly more total protein, as was already seen in pre-clinical DRG, suggesting that molecular alterations in central and peripheral nervous system during scrapie pathogenesis are similar time dependent events. SXRF microprobe results from trace metal imaging showed that copper, zinc and phosphorus are highest intracellular, while iron and calcium are abundant in the ECM. It was also shown that physiological concentrations of phosphorus are about a magnitude higher than that of calcium which in turn is about twice that of iron. Copper and zinc concentrations are about 2-3 times less than that of iron but about twice as much as manganese, the least concentrated of the studied elements. With scrapie infection, increase in copper, zinc, iron, calcium and manganese levels in scrapie infected animals was detected at the terminal stage of the disease, while potassium and phosphorus levels decreased. Furthermore, calcium levels were altered at pre-clinical time points, indicating to play an important role in scrapie pathogenesis at early time points. In order to investigate the specificity of these compositional changes to 263K scrapie infection, a similar set of experiments was performed on DRG infected with the ME7 scrapie strain and also hamster brain infected by Reovirus T3C9, another neurological disease. Specifically, alterations in the brains of reovirus infected animals were compared to those of terminally scrapie infected hamsters. Results showed that reovirus induces alterations in the same spectral region as scrapie. However, the appearance of a shoulder in original spectra at ~1050 cm-1, indicative of alterations in complex sugar ring vibrations of carbohydrates was not observed in the virus group and therefore possibly only occurs in scrapie. Finally, we compared compositional changes induced in DRG of hamsters by the two different scrapie strains 263K and ME7. Spectra from 263K and ME7 infected animals differed remarkably in several spectral regions. Firstly, both strains exhibited significantly more β-sheet compared to control, while ME7 showed even more than 263K. The result of the Western Blot analysis, however, did not indicate more PrPSc in the ganglia of ME7 infected animals. Therefore, the detected increase in β-sheet in ME7 infected animals might partly be caused by other proteins besides PrPSc, probably to a greater extent than was seen for 263K. Due to the integrative nature of information provided by FTIRM, the amide I band of tissue spectra represents the sum of all proteins in the investigated area, which might also explain why no remarkable differences between the strains in the amide I band were detected. Both 263K and ME7 exhibited significant differences in the lipid region (3000 2800 cm-1) compared to the control, ME7, again, greater than 263K, indicating changes in e.g. the neurons membrane system. Finally, ME7 and 263K exhibited oppositional changes in the peak intensities around 1238 cm-1 and ~1084 cm-1. Thus, ME7 and 263K induce different alterations in nucleic acid phosphodiester groups; sugarsm, phosphorylated lipids, proteins and other molecules. It seems therefore possible that the determined spectral patterns could even be specific on a strain level.Scrapie ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich durch die Ablagerung von fehlgefaltetem, pathologischem Prion-Protein, dem sogenannten PrPSc, im zentralen (und peripheren) Nervengewebe auszeichnet. Die Funktion des normalen, zellulären Prion-Proteins (PrPC) ist noch immer teilweise ungeklärt, jedoch konnte in in vitro Experimenten gezeigt werden, daß PrPC Kupfer bindet und somit eventuell eine Rolle im zellulären Kupfer Haushalt spielt. Dies wiederum könnte möglicherweise mit der Neurotoxizität der Krankheit in Verbindung stehen. Da die überwiegende Mehrheit von Studien an terminal erkrankten Tieren durchgeführt wurde, sind die molekularen Ereignisse, die der Familie der Prion Erkrankungen zugrunde liegen, besonders zu frühen, präklinischen Zeitpunkten, noch immer weitgehend unverstanden. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, die chemische Zusammensetzung auf zellulärer Ebene in Scrapie-infiziertem Nervengewebe über den Gesamtverlauf der Krankheit zu untersuchen, und eventuell Prion-Protein induzierte molekulare Veränderungen zu detektieren. Um dies zu erreichen wurde eine Zeitverlaufsstudie mit insgesamt 39 Tieren (24 infizierten und 15 Kontrollen) durchgeführt. Dabei wurden fünf verschiedene Zeitpunkte untersucht: 70 Tage nach Infektion (days post infection, dpi), 100 dpi, 130 dpi, bei Auftreten erster klinischer Symptome (first clinical signs, fcs, ~145 dpi) und bei Erreichen des terminalen Stadiums (~180 dpi). Das fehl gefaltete Prionprotein und seine Verteilung in Spinalganglien wurden einerseits mit Hilfe der Immunhistochemie zum Nachweis von PrPSc ermittelt, und andererseits die Sekundärstruktur mittels Fourier Transform Infrarotmikrospektroskopie untersucht. Des Weiteren wurde der Gehalt und die Verteilung von Spurenelementen, wie Kupfer, Eisen und Zink an sequenziellen Schnitten derselben Spinalganglien mit Hilfe der Röntgenfluoreszenzmikrospektroskopie ermittelt. Die Ergebnisse zeigten deutliche Änderungen der Sekundärstrukturverteilung der Proteine im infizierten Gewebe zu präklinischen Zeitpunkten. Im Einzelnen wiesen die Neuronen von Scrapie-infizierten Tiere einen signifikant erhöhten Proteingehalt auf, wobei sie, ebenfalls signifikant, weniger β-Faltblatt reiche Proteine als die Kontroll-Tiere zeigten. Regionen mit erhöhtem β-Faltblatt Anteil in frühen Stadien der Krankheit wurden ausschließlich im Bereich der Plasmamembran detektiert. Im Verlauf der Pathogenese erhöhte sich der relative Anteil an β-Faltblatt reichen Proteinen in den neuronalen Zellen der infizierten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen signifikant. Ein Vergleich mit denselben, anschließend immungefärbten Gewebeschnitten bestätigte, dass die detektierte Zunahme zumindest teilweise durch die Zunahme von pathologischem Prion-Protein verursacht war. Es konnte daher geschlußfolgert werden, dass die detektierten spektralen Veränderungen möglicherweise spezifisch für die Prionenerkrankung Scrapie sind. Ferner wurde festgestellt, dass im terminalen Stadium die Protein Expression signifikant erniedrigt ist, wahrscheinlich aufgrund des bereits induzierten Zelltodes. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine Überexpression von Proteinen mit geringem Anteil an β-Faltblatt charakteristisch zu sein scheint für das präklinische Stadium von Scrapie. Während der Pathogenese wird zelluläres PrPC schließlich in PrPSc umgewandelt, wahrscheinlich zusammen mit der Umwandlung oder Auswechslung weiterer α-Helix reicher Proteine zu bzw. gegen β\- Faltblatt reichen Proteinen. Die dramatischen Änderungen gerade in den asymptomatischen Tieren betont die Wichtigkeit, diese Proteine molekular zu identifizieren, um einerseits diese Art von Erkrankungen besser zu verstehen und andererseits eventuelle TSE Diagnostik- und Behandlungsmöglichkeiten voranzutreiben. Zusätzlich zu den Spinalganglien, die dem peripheren Nervengewebe zugehörig sind, wurden Hirne von 70 Tage infizierten Tieren mit Hilfe der Synchrotron IR Mikrospektroskopie untersucht. Bereits zu diesem sehr frühen Zeitpunkt wurden signifikante Unterschiede im Fingerprint Bereich des Spektrums detektiert, die auf molekulare Änderungen der Zusammensetzung in Nukleinsäuren, Kohlenhydraten oder Phospholipiden hindeuten. Ähnlich wie bei den Spinalganglien zeigten zwei der insgesamt fünf untersuchten infizierten Tiere einen verringerten Anteil an β-Faltblatt zusammen mit einem leicht erhöhten Anteil an Gesamtprotein im Gewebe des DMNV. Die Ergebnisse der Röntgenfluoreszenzmikrospektroskopie wiesen auf eine Rolle von Spurenelementen in der Pathogenese von Prion Erkrankungen hin. Anhand der Kontrolltiere konnte die normale, physiologische Verteilung der Spurenelemente ermittelt werden. Demnach sind Kupfer, Zink, Mangan und Phosphor hauptsächlich intrazellulär, während Eisen und Kalzium in höchsten Konzentrationen extrazellulär vorhanden sind. Ferner wurde gezeigt, dass die physiologische Konzentration von Phosphor etwa das Zehnfache der von Kalzium ist, welches wiederum ungefähr zweimal so hoch konzentriert vorliegt wie Eisen. Die Kupfer und Zink Konzentrationen sind ungefähr 2-3 mal kleiner als Eisen aber immer noch doppelt so hoch wie Mangan, welches die niedrigste Konzentration aller untersuchten Elemente aufwies. Im terminalen Stadium konnte in den infizierten Zellen eine Zunahme an Kupfer, Zink, Eisen, Kalzium und Mangan festgestellt werden, bzw. führte die Krankheit dazu, dass diese Elemente nicht, wie in den Kontrollen beobachtet, altersbedingt abnahmen. Im präklinischen Stadium lagen alle Spurenelemente in ungefähr gleichen Mengen in den infizierten Tieren den Kontrollen vor, einzig Kalzium war deutlich vermindert im Vergleich zur Kontrolle. Dies läßt auf eine Beteilung von Kalzium in frühen Stadien von Scrapie schließen, eventuell als Folge seiner Freisetzung aus intrazellulären Speichern während früher apoptotischer Ereignisse. Um die Spezifität der Scrapie induzierten spektralen Veränderungen zu bestimmen, wurden Spektren von Spinalganglien terminal an 263K Scrapie erkrankter Hamster mit denen von ME7 Scrapie infizierten Tieren verglichen. Ferner wurden spektrale Änderungen im DMNV des Hirnes von 263K infizierten Tieren mit denen von Reovirus infizierten neugeborenen Hamstern verglichen. Reovirus T3C9 induziert eine letale Enzephalitis im Hirn von neonatalen aber nicht adulten Tieren und erreicht als erste Struktur im Hirn, analog zu 263K Scrapie, den DMNV. Zunächst konnte festgestellt werden, dass der DMNV von Reovirus infizierten Tieren spektrale Änderungen in der gleichen spektralen Region aufwiesen wie die 263K Scrapie infizierten Tiere. Allerdings könnte das ausschließliche in den Scrapie- infizierten Tieren auftretende Signal bei ~1050 cm-1, welches auf Änderungen in Kohlehydraten hindeutet, spezifisch für diese Krankheit sein. Der Vergleich der spektralen Veränderungen in Spinalganglien von Tieren, die mit zwei unterschiedlichen Scrapie Stämmen infiziert wurden, zeigte ebenfalls distinkte spektrale Merkmale. Zum einen wiesen beide Stämme einen signifikant erhöhten Anteil an β-Faltblatt auf, ME7 allerdings mehr als 263K. Da die Western Blot Analysen nicht zeigten, dass die ME7 infizierte Tiere einen höheren Anteil an PrPSc besitzen, kann geschlussfolgert werden, dass noch weitere Proteine neben dem Prion-Protein im Verlauf der Pathogenese vermehrt auftreten, und zwar bei ME7 in einem größeren Ausmaß als bei 263K infizierten Tieren. Darüber hinaus induzierten beide Stämme spektrale Veränderungen, die auf Unterschiede im Lipid Haushalt hindeuteten, und auch hier wiederum stärker ausgeprägt in den ME7 infizierten Tieren. Während Änderungen im Lipid und Amid Bereich bei beiden Stämmen in die gleiche Richtung zeigten und nur in ihrem Ausmaß variierten, konnte im Fingerprint Bereich des Spektrums festgestellt werden, dass die Proben ME7 und 263K infizierter Tiere gegensätzliche Änderungen in den Peak Intensitäten bei etwa 1238 cm-1 und 1084 cm-1 zeigten. Offensichtlich führt die Infektion mit verschiedenen Scrapie Stämmen zu unterschiedlichen spektralen Mustern im Fingerprint Bereich des Spektrums, was auf Unterschiede in Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Phospholipiden oder anderen Molekülgruppen hindeutet. Die Daten weisen daher darauf hin, dass die detektierten spektralen Profile auch auf Stamm-Ebene spezifisch sein könnten