Influence of peroxisomes on development, maturation and adult functions of the testis

Peroxisomes are ubiquitous cell organelles with heterogeneous enzyme composition and functions, depending on the metabolic needs of different cell types, tissues and organ systems. However, until the beginning of the experimental work of this thesis hardly any knowledge was available on the metabolic functions of these cell organelles in the testis, despite the well-known severe pathological alterations in this organ in patients suffering from peroxisomal diseases. Male children with Zellweger syndrome, the most severe form of a peroxisomal biogenesis disorder, exhibit cryptorchism and patients with X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD), a single enzyme defect of a peroxisomal ABC transporter for lipids, show an impairment of testicular functions in 80% of the cases. Therefore, the main goals of this thesis were to characterize the peroxisomal distribution and enzyme composition in distinct cell types of normal mouse and human testis and to analyse the molecular consequences of peroxisome deficiency and its influence on male fertility. To get a complete overview on the peroxisomal compartment and its enzyme composition in the testis in normal mice and on the alterations in scsPex13 knockout mice, routine histological analyses with HE-stained material, Oil red O staining on frozen sections, TUNEL, immunofluorescence and immunohistochemistry with a variety antibodies against peroxisomal and cell marker proteins, electron microscopy, laser-assisted microdissection (LAMD), isolation of different testicular cell types and primary cell culture, cell and tissue homogenisation, subcellular fractionation and organelle isolation, Western blot analysis, lipid extraction, fatty acid and steroid (androgen) analyses by GC-MS, genomic DNA isolation, PCR genotyping, total RNA isolation, RT-PCR analyses and RNAi on primary Sertoli cells were used. The results of this thesis indicate that peroxisomes in distinct cell types of the testis exhibit specific enzyme composition and serve divers functions already under normal physiological conditions. Despite older reports from the literature on the exclusive presence of these organelles in Leydig cells, in this study peroxisomes were identified with new specific markers in all testicular cell types, including developing germ cells (except for mature spermatozoa). Peroxisomes alter their matrix protein composition, aggregate in clusters during spermiogenesis in late stages of elongated spermatids (step 14 to 16) and are transported into the cytoplasmic droplets and residual bodies, which are subsequently phagocytosed by Sertoli cells. The highest enrichment of peroxisomal lipid transporters (ABCD1 and ABCD3) as well as of ACOX2, the key regulatory enzyme of the b-oxidation pathway 2 for side-chain oxidation of cholesterol and medium levels of catalase were found in Sertoli cells, suggesting peroxisomes as protectors against lipid toxicity and oxidative stress to prevent germ cell apoptosis. Leydig cells were selectively enriched in catalase and ABCD2, indicating that peroxisomes are important also in this cell type for the protection of steroidogenesis against ROS and for lipid homeostasis. Comparative immunofluorescence analysis revealed that distribution, abundance and enyzme composition of peroxisomes were conserved between mouse and man. To study the molecular consequences of peroxisomal dysfunction on male fertility, a Sertoli cellspecific knockout mouse was generated by AMH-cre-mediated excision of exon 2 of the Pex13 gene, encoding a protein of the docking complex on the peroxisomal membrane involved in matrix protein import into the organelle. Due to the absence of PEX13 protein and deficient matrix protein import, all matrix proteins, such as catalase and thiolase, were mislocalized into the cytoplasm in Sertoli cells. Few peroxisomal membrane ghosts, positive for PEX14 were still present in this cell type surrounding large lipid droplets. Within 130 days of postnatal development, the scsPex13KO animals developed a complete Sertoli cell only syndrome. TUNEL preparations of paraffin sections revealed that germ cell apoptosis occurred between 90 and 130 days of postnatal development. A strong increase of neutral lipids, such as triglycerides and cholesteryl esters was observed in Sertoli cells of the seminiferous tubules of P130 scsPex13KO animals. The accumulation of peroxisome-metabolised fatty acids (VLCFA, pristanic and phytanic acid) in frozen testis samples suggested the deficiency of peroxisomal a- and b-oxidation. Steroid measurements revealed normal testosterone levels, but a strong accumulation of dehydroepiandrosterone (DHEA) and a decrease of all other androgen precursors, suggesting a block of the D5 pathway in these animals. The expression of mRNAs for the FSH- and LHreceptors was significantly increased and the ones for transcription factors (Sf1, Gata4) and enzymes for steroidogenesis (Star, Cyp450scc, Cyp450c17, 3b-Hds) were elevated in Sertoli cells as well as in Leydig cells of scsPex13KO mice. Specific Sertoli cell markers were also enhanced (Inha, Trf, Sgp2). Strongly proliferated Leydig cells seemed to dramatically upregulate their peroxisomal compartment and exhibited a strong increase of peroxisomal ABCDtransporters. Ultrastructural analysis of different subcellular compartments revealed mitochondria with rearrangement of their cristae and giant whorl-like structures of SER in Leydig cells. Mitochondria in Sertoli cells were proliferated and exhibited extremely high levels of SOD2. Strong ROS production and a similar increase in mitochondrial SOD2 were detected in primary Sertoli cells with a siRNA-mediated knockdown of the Pex13 gene. Peroxisomal dysfunction in Sertoli cells led to an induction of constitutive and inducible cyclooxygenases (COX1, COX2), production of pro-inflammatory cytokines (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) and local testicular inflammation, showing infiltration of macrophages in the interstitial space of the testis in scsPex13KO animals. In conclusion, peroxisomes in Sertoli cells are essential organelles in the testis for male fertility which (1) regulate lipid homeostasis in the seminiferous tubules, (2) protect spermatogenesis against oxidative stress due to ROS increase, (3) are involved in androgen precursor synthesis and keep androgens in balance, and (4) protect against inflammation through the degradation of bioactive lipid mediators (e.g. arachidonic acid or eicosanoids). Since peroxisomal enzyme composition is similar between mice and humans, scsPex13 knockout mice provide an excellent model system to study human infertility due to peroxisomal deficiency. Future studies on tissue samples from infertile patients are needed to clarify in which extent peroxisomes are involved in the pathogenesis of idiopathic infertility.Peroxisomen sind ubiquitäre Zellorganellen, die abhängig von metabolischen Anforderungen in unterschiedlichen Zelltypen, Geweben und Organsystemen eine heterogene Enzymzusammensetzung und unterschiedliche Funktionen aufweisen. Über die metabolische Funktion dieser Organellen im Hoden standen zu Beginn der experimentellen Arbeiten zu dieser Dissertation jedoch kaum Informationen in der Literatur zur Verfügung, obwohl ausgeprägte pathologische Veränderungen in diesem Organ bei Patienten mit peroxisomalen Krankheiten auftreten. So weisen Knaben mit Zellweger-Syndrom, der schwersten Form eines peroxisomalen Biogenesedefektes, Kryptorchismus auf und Patienten mit X-chromosomaler Adrenoleukodystrophie (X-ALD), einem Einzelgendefekt eines peroxisomalen ABC-Transporters für Lipide, zeigen in 80% der Fälle eine Beeinträchtigung der testikulären Funktion. Deshalb bestanden die Hauptziele dieser Dissertation darin, die Verteilung und Enzymzusammensetzung der Peroxisomen in verschiedenen Zelltypen des Hodens der Maus und des Menschen im Vergleich zu charakterisieren sowie die molekulare Pathogenese der durch Peroxisomendefizienz ausgelösten Veränderungen zu analysieren und deren Einfluss auf die männliche Fertilität nachzuweisen. Um einen Überblick über das peroxisomale Kompartiment im Hoden von Wildtyp-Mäusen und über die Veränderungen in Sertolli-Zell-spezifischen Pex13 Knockout-Mäusen (scsPex13KO) zu erhalten, wurden folgende Methoden in dieser Dissertation etabliert und angewandt: Morphologische Analyse HE-gefärbter histologischer Präparate, Ölrot O-Färbung von Gefrierschnitten, TUNEL, Immunofluoreszenz und Immunohistochemie mit unterschiedlichen Antikörpern gegen peroxisomale und zelltypspezifische Markerproteine, Elektronenmikroskopie, lasergestützte Mikrodissektion, Isolierung und Kultivierung verschiedener primärer Zellen aus Hodengewebe, Western-Blot-Analysen, Lipidextraktion, Fettsäure- und Steroidanalysen mittels GC-MS, Isolierung genomischer DNA und PCR-Genotypisierung, Isolierung von Gesamt-RNA und RT-PCR Expressionsanalysen, RNAi-Knockdown des Pex13 Gens in primären Sertolizellen, ROS-Nachweis an primären Sertoli-Zellen mittels DHEFluoreszenz. Die Resultate dieser Dissertation zeigen eindeutig, dass Peroxisomen in den spezifischen Zelltypen des Hodens schon unter physiologischen Bedingungen unterschiedliche Enzymzusammensetzung besitzen und verschiedene Funktionen erfüllen. Im Gegensatz zu Literaturangaben über das Vorkommen der Peroxisomen ausschließlich in Leydig-Zellen wird in der vorliegenden Dissertation die Existenz dieser Zellorganellen in allen Zelltypen des Hodens, sogar in Keimzellen (mit Ausnahme gereifter Spermien), nachgewiesen. Peroxisomen ändern ihre Matrixproteinzusammensetzung und „clustern“ (bilden Gruppen) im Verlauf der Spermiogenese in späten Stadien elongierter Spermatiden (Stadium 14-16); sie werden in Residualkörper transportiert und durch anschließende Phagozytose in Sertolizellen abgebaut. Die höchste Anreicherung der peroxisomalen Lipidtransporter ABCD1 und ABCD3 sowie von ACOX- 2, des Schlüsselenzyms des 2. b-Oxidationswegs zur Seitenkettenoxidation von Cholesterin und auch ein relativ hohes Katalasevorkommen wurden in Sertoli-Zellen nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass Peroxisomen in Sertoli Zellen vor Lipidtoxizität und oxidativem Stress schützen. Leydig-Zellen dagegen waren besonders mit Katalase angereichert und enthielten auch hohe Mengen ABCD2. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass Peroxisomen in diesen Zellen die Steroidbiosynthese vor den toxischen Wirkungen von ROS schützen und die Lipidhomöostase regulieren. Vergleichende Immunofluoreszenzanalysen von murinen und humanen Proben erbrachten, dass sich Verteilung, Menge und Enzymzusammensetzung der Peroxisomen zwischen den beiden Spezies nicht grundsätzlich unterscheiden. Um die molekularen Konsequenzen peroxisomaler Dysfunktion auf die männliche Fertilität zu untersuchen, wurde eine Sertoli-Zell-spezifische Knockout-Maus durch AMH-cre vermittelte Exzision des Exons 2 des Pex13-Gens hergestellt. Das Pex13-Gen kodiert ein Protein des Docking-Komplexes der Peroxisomenmembran, das in den Matrixproteinimport eingeschaltet ist. Durch das Fehlen des PEX13-Proteins (PEX13p) blieben alle peroxisomalen Matrixproteine, wie z.B. Katalase und Thiolase, im Zytoplasma der Sertoli-Zellen fehllokalisiert. Einige wenige Pex14p-positive peroxisomale Membranreste („ghosts“) waren um große Lipidtropfen herum detektierbar. Innerhalb von 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung bildeten die scsPex13- Knockout-Mäuse ein komplettes „Sertoli cell only“-Syndrom aus. In TUNEL-Präparationen von Paraffinschnitten konnte der Keimzellverlust durch Apoptose innerhalb des Zeitraums zwischen 90 und 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung nachgewiesen werden. ScsPex13 Knockout- Mäuse (P130) wiesen einen starken Anstieg neutraler Fettsäuren und von Cholesterinestern in Sertoli-Zellen der Tubuli seminiferi auf. Der Nachweis der Akkumulation von peroxisomenspezifischen Fettsäuren (sehr langkettige Fettsäuren, Pristan- und Phytansäure) in Gefrierschnitten ließ weiterhin eine Defizienz von peroxisomaler a- und b-Oxidation vermuten, was durch die Fehllokalisation von ACOX1 und Thiolase erklärt werden konnte. Steroidanalysen erbrachten normale Testosteronspiegel, jedoch eine starke Erhöhung von Dehydroepiandrosteron (DHEA) und die Verminderung aller anderen Androgenvorläufer, was durch eine Blockierung des D5-Stoffwechselweges auf Höhe der peroxisomalen 17b-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (multifunktionelles Protein 2 = MFP2) in diesen Tieren erklärbar ist. Eine signifikante Erhöhung der mRNA-Expression der FSH- und LH-Rezeptoren sowie der Transkriptionsfaktoren (Sf1, Gata4) und der Enzyme für die Steroidsynthese (Star, Cyp450scc, Cyp450c17, 3bHsd) wurde in Sertoli- und in Leydig-Zellen festgestellt. Auch die mRNAs spezifischer Sertoli-Zell-Marker waren induziert (Inha, Trf, Sgp2). Die stark proliferierten Leydig-Zellen des Interstitiums wiesen eine Vermehrung des peroxisomalen Kompartiments auf und zeigten eine starke Erhöhung der Proteinmenge von peroxisomalen ABC-Transportern. Die ultrastrukturelle Analyse verschiedener subzellulärer Kompartimente in diesen Zellen erbrachte Mitochondrien mit veränderten Cristae und große schneckennudelartige („whorl-like“) Aggregate des glatten ERs. Mitochondrien in Sertoli-Zellen wurden vermehrt aufgefunden und enthielten hohen Mengen vonn SOD2. Eine starke Induktion der ROS-Produktion und eine Erhöhung der Zusammenfassung 149 / 169 SOD2 konnten experimentell auch durch siRNA-ausgelösten Knockdown des Pex13-Gens in primären Sertoli-Zellen ausgelöst werden. Weiterhin führte die peroxisomale Dysfunktion in Sertoli-Zellen zu einer Induktion der konstitutiven und induzierbaren Formen der Cyclooxygenasen (COX1, COX2), zu der vermehrten Produktion von proinflammatorischen Cytokinen (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) und einer Hodenentzündung mit Makrophageninfiltration im Interstitium in scsPex13 Knockout-Mäusen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Peroxisomen in Sertoli-Zellen essentielle Zellorganellen zur Erhaltung der männlichen Fertilität darstellen, die 1) die Lipidhomöostase in Tubuli seminiferi regulieren, 2) die Spermatogenese gegen oxidativen Stress durch Erhöhung von ROS schützen, 3) in die Androgensynthese eingeschaltet sind und das Androgengleichgewicht regulieren und 4) vor Entzündungen des Hodens durch den Abbau von bioaktiven Lipidmediatoren (z.B.: Arachidonsäure und Eicosanoide) schützen. Da eine ähnliche Enzymzusammensetzung im Hoden der Maus und des Menschen nachgewiesen werden konnte, stellen die scsPex13 Knockout-Mäuse ein ideales Modellsystem zum Studium männlicher Infertilität durch peroxisomale Dysfunktion dar. Zukünftige Studien mit Gewebeproben von infertilen Patienten sind jedoch notwendig, um aufzuklären, welche Rolle der peroxisomale Stoffwechsel in der Pathogenese von idiopathischer Infertilität beim Mann spielt