Plasma protein adsorption patterns on intravenously injectable colloidal drug carriers for drug delivery across the blood-brain barrier

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung und Zielsetzung Allgemeiner Teil Materialien Methoden Ergebnisse und Diskussion Zusammenfassung Summary Anhang Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Publikationsliste Danksagung LebenslaufIm Rahmen dieser Arbeit wurde die Adsorption von Plasmaproteinen auf verschiedenen potentiellen, kolloidalen Arzneistoffträgern mittels zwei- dimensionaler Polyacrylamid Gelelektrophorese (2-DE) analysiert. Im Mittelpunkt standen dabei feste Lipidnanopartikel (SLN), da ihnen, aufgrund ihrer guten Verträglichkeit in vivo und der Möglichkeit zur Produktion im großtechnischen Maßstab, ein hohes Marktpotential zugeordnet werden kann. Außerdem wurden Fettemulsionen, Nanopartikel aus Gelatine und spezielle Polymerpartikel (MC81cs) untersucht. Um die 2-DE-Analytik auf SLN zu übertragen, wurde zunächst die Gelfiltration als universell einsetzbare Methode zur Abtrennung von SLN von überschüssigem Plasma etabliert. Danach wurden die optimalen Parameter der Probenaufbereitung von Cetylpalmitat-SLN mittels Zentrifugation bestimmt (drei Waschschritte mit 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4). Die Inkubation von SLN in Plasmen unterschiedlicher Spender hatte ebenso wenig einen Einfluss auf die resultierenden Proteinmuster, wie die unterschiedliche Stabilisation der Plasmen mit Natriumcitrat bzw. Natrium-EDTA oder das Einfrieren der Plasmen über vier Monate bei 70°C. Die Inkubation von ausgewählten SLN-Formulierungen in Serum konnte zeigen, dass keine Aktivierung des Komplementsystems stattfand. Außerdem wurde gezeigt, dass die Verwendung von IPG-Strips mit linearem Gradienten eine gute Alternative darstellt, um die adsorbierten Mengen von ApoC-III, ApoC-II und ApoA-II zu differenzieren. Nach Klärung der wichtigsten methodischen Parameter der 2-DE-Analytik mit SLN erfolgte ein Rezepturscreening mit Variation der verwendeten Tenside. Primäres Ziel war dabei die Anreicherung von ApoE auf der Oberfläche der SLN, um einen Arzneistoffcarrier zu entwickeln, der - ähnlich wie Polybutylcyanoacrylat (PBCA)-Nanopartikel - einen Transport über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ermöglicht, jedoch nach i. v. Injektion besser verträglich ist. Durch Herstellung unterschiedlicher Tensid-Reihen konnten erste Korrelationen zwischen den Oberflächeneigenschaften der untersuchten Cetylpalmitat-SLN (bzw. den Eigenschaften der eingesetzten Tenside) und der resultierenden Plasmaproteinadsorptionsmuster aufgestellt werden. Ein wichtiges Ergebnis in diesem Zusammenhang war die Feststellung, dass die adsorbierten Mengen von ApoE bzw. ApoA-IV mit steigender Polyethylenoxid-Kettenlänge der verwendeten Block-Copolymere exponentiell bzw. annähernd linear abnahmen. In der Reihe der untersuchten Block-Copolymere zeichnete sich insbesondere der P-gp-Hemmer Poloxamer 235 durch den höchsten ApoE/ApoC-II-Quotienten in Verbindung mit der zweithöchsten Menge ApoA-IV als für das Gehirn-Targeting sehr interessantes Tensid aus. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die adsorbierten Mengen von ApoE bzw. ApoA-IV mit kleiner werdendem HLB-Wert der Polysorbate kontinuierlich zunahmen. Neben Poloxamer 235 und Polysorbat 80 erwiesen sich Poloxamer 184, Lecithin und TPGS (ein weiterer P-gp-Hemmer) als geeignete Tenside, um das Proteinmuster zu optimieren. Im nächsten Schritt wurde gezeigt, dass das verwendete Matrixlipid einen großen Einfluss auf das resultierende Adsorptionsmuster hat, wobei bei gleicher sterischer Abschirmung, Partikelgröße bzw. -ladung die Oberflächenhydrophobie des Lipids die entscheidende Rolle spielte. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse der Cetylpalmitat-SLN durchaus auf andere SLN, die von Lipiden mit ähnlicher Hydrophobie gebildet werden (z. B. Compritol oder Witepsol E85), übertragbar sind. Im weiteren Vorgehen wurde die Kinetik bei der Adsorption von Plasmaproteinen auf SLN untersucht. Es wurde zwar wie bei Polystyrol-Partikeln ein Vroman-Effekt festgestellt, jedoch beschränkte sich diese Verdrängung von Fibrinogen durch Apolipoproteine auf die erste Adsorptionsphase (Subsekundenbereich). Bei längerer Kontaktzeit (Minuten- und Stundenbereich) zeigten sich die Adsorptionsmuster von oberflächenmodifizierten SLN als viel weniger zeitabhängig (ähnlich bei O/W-Emulsionen) als die von oberflächenmodifizierten Polystyrol-Partikeln. Darüber hinaus konnte auch die physiologische Stabilität von SLN nachgewiesen werden, denn die Proteinmuster von physikochemisch stabilen SLN waren über mindestens zwei Jahre Lagerung stabil. Diese Feststellungen bildeten weitere wichtige Grund-lagen für die gezielte Entwicklung von SLN als Arzneistoffcarrier über die BHS. Neben SLN wurden auch die Plasmaproteinadsorptionsmuster von Fettemulsionen untersucht, die als Träger für das Narkosegas Xenon entwickelt wurden und in vivo am Schwein getestet wurden. Es zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Proteinadsorption von der jeweiligen Tröpfchengröße (Oberflächenkrümmung). Obwohl die Rezepturoptimierung von Abbolipid 10% mit Polysorbat 80 nicht zu der erwarteten Zunahme der Adsorption von ApoE führte, konnte mit dieser Formulierung die beste klinische Wirkung erzielt werden. Die Tatsache, dass Xenon auch ohne Transportvektor die BHS passieren kann, erschwerte allerdings auch die Korrelation der Proteinmuster mit dem klinischen Effekt. Davon abgesehen waren die klinischen Erfolge einer Injektionsnarkose mit Xenon- beladenen Fettemulsionen sehr viel-versprechend, da sie (aufgrund eines viel geringeren Verbrauchs im Vergleich zur Inhalationsnarkose) das Wirtschaftlichkeitsproblem bei der Verwendung von Xenon als Narkosegas lösen könnten. Auf diese Weise könnte Xenon, das viele Kriterien eines idealen Narkosegases erfüllt, einen erfolgreichen Weg zur regelmäßigen Anwendung am Patienten antreten. Des weiteren wurden erste Untersuchungen zur Plasmaproteinadsorption auf Nanopartikeln aus Gelatine (Gelatine-NP) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Apolipoproteine keineswegs auf allen Carriersystemen die dominierende Proteinspezies darstellt, da sie auf Gelatine-NP über einen relativen Anteil von ca. 3% nicht hinaus kamen. Aufgrund der bestimmten Proteinadsorptionsmuster scheinen positiv geladene Gelatine-NP ein geeignetes Gentransfersystem zu sein für ein passives Targeting zur Aufnahme in immunkompetente Zellen. Ein Gehirn-Targeting dürfte mit diesen Partikeln jedoch eher schwierig zu realisieren sein. Außerdem wurde gezeigt, dass die Oberflächenmodifikation von Gelatine-NP mit Cholamin einen größeren Einfluss auf das Proteinmuster hat, als die anschließende Bindung eines Oligonukleotids an die Oberfläche der positiv geladenen Partikel. Zusätzlich wurde die Proteinadsorption nach Inkubation in Rattenplasma bestimmt, anhand deren Muster die gleichen Schlussfolgerungen gezogen werden konnten. Die Analyse der Proteinadsorption auf arzneistoffbeladenen bzw. unbeladenen Kern-Schale-Nanopartikeln nach Inkubation in Humanplasma lieferte Muster, die sehr stark von Apolipoproteinen dominiert (über 90%) und untereinander sowohl qualitativ als auch quantitativ sehr ähnlich waren. Aufgrund der durchgeführten In-vitro-Zellversuche mit Makrophagen erfolgte zusätzlich die Analyse der Proteinadsorption nach Inkubation in dem verwendeten Zellmedium. Auch hier waren die Muster untereinander relativ ähnlich, jedoch waren sie (aufgrund von anderen Konzentrationsverhältnissen) nicht ganz so stark geprägt von Apolipoproteinen. Die In-vitro-Studie lieferte das überraschende Ergebnis einer leichten Überlegenheit von unbeladenen gegenüber arzneistoffbeladenen Polymerpartikeln hinsichtlich des therapeutischen Effekts. Dies konnte unter anderem durch die Tatsache der höheren Adsorption von Opsoninen auf den unbeladenen Partikeln erklärt werden. Dieser Unterschied war zwar nicht besonders stark ausgeprägt, jedoch zeigte dieses Ergebnis gerade auch deshalb die Bedeutung auch kleinster Verschiebungen im Proteinmuster, für den Fall, dass sie Proteine betreffen, die für den beobachteten Vorgang entscheidend sind. Die Untersuchungen unterschiedlicher Arzneistoffsysteme, die für eine i. v. Applikation am Menschen in Frage kommen, zeigten, dass SLN aufgrund ihrer physikochemischen Ähnlichkeit zu Lipoproteinpartikeln sehr gut geeignet sind, um ein ideales Plasmaproteinadsorptionsmuster zur Überwindung der BHS auszubilden. Da dieses Muster dann auch während der Zirkulation im Blutstrom bestand hat und sich auch nach längerer Lagerung der Dispersion reproduzierbar ausbildet, wurde die Basis für die Entwicklung eines gut verträglichen und im industriellen Großmaßstab einfach herstellbaren Arzneistoffcarrier, der zu einem Gehirn- Targeting führen kann, gelegt. In der weiteren Entwicklung dieses Systems gilt es zu überprüfen, ob bzw. inwieweit sich die Plasmaproteinadsorptionsmuster von SLN nach Beladung mit einem Arzneistoff ändern. Es ist jedoch zu erwarten, dass - ähnlich wie bei bereits untersuchten Fettemulsionen oder Polymerpartikeln - die festgestellten Muster bestand haben, zumindest für den Fall, dass man einen Arzneistoff wählt, der sich innerhalb der Partikel aufhält. Aus Sicht der Arzneistoffbeladung ist es ein weiteres interessantes Ziel, die 2-DE Analytik und die bisher ermittelten Erkenntnisse auf die zweite Generation der Lipidnanopartikel, die NLC (Nanostrukturierte Lipidcarrier) zu übertragen, da diese eine höhere Beladungkapazität aufweisen. Außerdem gilt es zu klären, inwieweit die in dieser Arbeit (weitgehend anhand von früheren In- vivo-Studien) aufgestellten Vermutungen hinsichtlich der Organverteilung im Tierversuch bestätigt werden können.This thesis investigated the adsorption of plasma proteins on various colloidal drug carriers by the mean of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE). The main focus was on solid lipid nanoparticles (SLN), as they showed a very good tolerability in vivo and do not have any problems with respect to large scale production. Moreover, fat emulsions, gelatin nanoparticles and core-shell latex nanoparticles (MC81cs) were investigated. For the transfer of 2-D PAGE analysis to SLN, gel filtration was established as reliable method to separate all types of SLN from excess plasma. Beside this, the optimal parameters of sample preparation of cetyl palmitate-SLN via centrifugation were determined (three washing steps using 20 mM phosphate buffer pH 7.4). Incubation of SLN in plasmas of different donors, different stabilisation of the plasmas (sodium citrate vs. sodium EDTA) and freezing of the plasmas over four months at 70°C had no influence on the resulting protein adsorption patterns. Incubation of selected SLN formulations in serum revealed no complement activation. Furthermore, it was shown that linear gradient IPG-strips are a good alternative to distinguish between adsorbed amounts of apoC-III, apoC-II and apoA-II. Thereafter, SLN were surface-modified with a range of interesting surfactants to assess the influence on the resulting protein adsorption patterns. Priority objective was enrichment of apoE on the surface of SLN, to investigate an in vivo well- tolerable carrier, which is able to transport drugs across the blood brain barrier (BBB). An important result was that apoE and apoA-VI were preferentially adsorbed, when the SLN were stabilised with block-copolymers having a low number of polyethylene oxide units. Especially poloxamer 235, as an inhibitor of P-glycoprotein (P-gp), is a promising surfactant to be used to deliver drugs to the brain, because it showed the highest apoE/apoC-II ratio. Moreover, it was shown that the amount of adsorbed apoE and apoA-VI on SLN decreased with increasing HLB values of the used polysorbate surfactants. Beside poloxamer 235 and polysorbate 80, poloxamer 184, lecithin and TPGS (another P-gp inhibitor) seemed to be the most promising surface-modifiers to optimise plasma protein adsorption patterns on SLN. In the next step, it was shown that the matrix lipids play an important role for the resulting patterns. However, in case of similar surface hydrophobicities of the bulk media (e. g. Cetyl palmitate, Compritol or Witepsol E85, respectively), adsorption patterns were very similar. Furthermore, the adsorption kinetics of plasma proteins on SLN were determined. Employing diluted human plasma, a transient adsorption of fibrinogen was observed on the surface of SLN, which in plasma of higher concentrations was displaced by apolipoproteins. This phenomenon is called Vroman-effect and was previously determined on other solid surfaces. However, over a period of minutes and hours, no relevant changes in the composition of the adsorbed proteins on SLN were detected, which was in agreement with former investigated fat emulsions but in contrast to polymer nanoparticles. As there was no competitive displacement of apolipoproteins, the stable patterns may be better exploited for drug targeting than particles with a pattern being very dependent on contact time with plasma. Moreover, the adsorption patterns on physically long-term stable SLN dependent on their age were determined. No considerable changes were found, supporting the same organ distribution independent on storage time ( physiological stability ). These results provide an important basis for the development of SLN for intravenous drug targeting to the BBB. In the next part of this thesis, the adsorption patterns of fat emulsions as delivery system for intravenous anaesthesia of xenon were determined. Modification of Abbolipid 10% with polysorbate 80 did not lead to the expected higher amounts of apoE. Nevertheless, this formulation showed the best clinical effect. It has to be taken into account, that correlation of plasma protein adsorption data with the observed clinical effects was difficult, because Xenon is able to pass the BBB on his own. Beside this, the clinical results with i. v. injected Xenon-emulsions were quite promising to solve the known economical problems, which occur when using Xenon as an inhalational anaesthetic. Moreover, plasma protein adsorption patterns on gelatin nanoparticles (gelatin-NP) were determined for the first time. The results showed that not all adsorption patterns of drug delivery systems are dominated by apolipoproteins. The highest percentage of apolipoproteins on gelatin-NP was 3%. In order to bind DNA by electrostatic interactions onto the surface of the gelatin-NP, the quaternary amine cholamine was covalently coupled to the particles. The adsorption patterns of these positively charged gelatin-NP were slightly modified. However, subsequent binding of an oligonucleotide to the surface of these particles had no effect on the adsorption patterns. Additionally, protein adsorption patterns after incubation in rat plasma were determined. The same conclusions could be drawn when looking on the resulting patterns. In the final part of this thesis, protein adsorption on core-shell latex nanoparticles (drug loaded and free of drug, respectively) were investigated. The resulting patterns seemed to be similar and once more the apolipoproteins were the dominant proteins (>90%). Moreover, adsorption patterns after incubation in fetal bovine serum (FBS) were determined, as this medium was used for in vitro cell-studies. As a result of different protein composition in the media, protein patterns looked different in comparison to human plasma protein patterns. However, among each other they seemed to be similar again. Surprisingly, in vitro cell-studies with macrophages (infected by Toxoplasma gondii) showed that nanoparticles free of drug (MC81cs) had a therapeutic effect. This effect was even (slightly) stronger than that of nanoparticles loaded with Pentamidine or Spiramycine. It is possible that the effect of MC81cs in counteracting or neutralising the suppression of defence of host cell by the parasite is more effective than the sole or additional effect of the drug (which has a low efficacy anyway). Moreover, percentages of adsorbed opsonins on MC81cs were (slightly) higher in comparison to drug loaded particles, which could be a reason for more efficient phagocytosis, showing the importance of (even minor) variations in plasma protein adsorption patterns. Investigations of different, intravenously injectable colloidal drug carriers showed that apolipoproteins have a great affinity to SLN, because these particles also have a lipid core like lipoproteins. Surface modifications of SLN using surfactants like poloxamer 235 and polysorbate 80 resulted in accumulation of apoE and the absence of typical opsonins on the surface. The adsorption patterns of SLN were stable, neither they depended on contact time with plasma nor on storage time of the dispersions. In conclusion, SLN are suitable carriers to be biofunctionalised with apoE in the blood and may have a high potential to deliver drugs to the brain