Computergestützte Untersuchung herpesviraler Proteine und deren Rolle in der Pathogen-Wirt-Interaktion

Herpesviruses are small pathogenic agents that cause diseases in animals and humans and persist lifelong in their natural host after primary infection. At least five human herpesviruses have a very high prevalence in the human population. In order to control the viral spread and treat associated diseases, development of antiviral agents that target crucial proteins of the viral life cycle is of outmost importance. Thus, a profound knowledge of the structure and mechanism of viral effectors is critical. A static structure of a protein obtained by X-ray crystallography already gives an important understanding of its fold and function. In addition, computational biology provides methods which allow analysis of the protein dynamics and can therefore complement the experiment. In the present work, computational methods were applied to investigate host-pathogen interactions of herpesviral proteins by studying their receptor binding, recognition by antibodies, and formation of homo- and hetero-oligomers. For infection, all herpesviruses employ a machinery of glycoproteins in order to fuse with the target cell and overcome the lipid membrane barrier. Herpes simplex virus-1 (HSV-1), which causes watery blisters and lesions of mouth and lips, requires four glycoproteins for fusion including glycoprotein D (gD). On its target cell, gD recognizes two structurally distinct cellular receptors, namely herpes virus entry mediator (HVEM) and nectin-1, and triggers fusion upon binding. Interaction with the two receptors is accompanied by intramolecular structural rearrangements in gD including the detachment of the C-terminus or formation of an N-terminal hairpin structure. In the present work, several gD mutations were investigated that had been reported to effect receptor binding affinity or specificity in order to identify their molecular mode of action. Molecular dynamics (MD) simulations showed that mutations not only affect the gD-receptor interface itself but can also have an effect on the intramolecular structural rearrangement processes in gD. In particular, W294A and Q27A mutations facilitate the detachment of the C-terminus. Moreover, Q27A hampers the proper formation of the intramolecular hairpin in gD, which is exclusively established upon HVEM binding. The finding that a Q27A mutation affects multiple steps in the receptor-binding process offers a molecular explanation for its enhanced nectin-1 affinity and the pronounced receptor specificity. In addition, this work indicates that an inspection of the gD-receptor interfaces alone may be insufficient for predicting the effect of novel mutations that alter receptor specificity. Instead, such an analysis will additionally require to assess the effect of mutations on the preceding steps of gD receptor binding. The second part of this work addressed neutralizing antibodies that are directed against domain-II (DOM-II) of human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein B (gB). Infection with HCMV usually proceeds unnoticed; however, it is a serious health risk for immunocompromised patients and newborns. Since gB represents the active fusion protein in HCMV, a profound understanding of antigen recognition by neutralizing antibodies is crucial. The recent crystal structure of the high-affinity antibody SM5-1 bound to a DOM-II construct already gave a first insight into important determinants of antigen binding. However, comparing SM5-1 to less mature antibodies raised the question of how the occurrence of somatic mutations could enhance the binding affinity by two orders of magnitude in SM5-1. In the present work, MD simulation and subsequent analysis of the SM5-1-DOM-II complex revealed that six residues, which emerge late in somatic maturation process of SM5-1, do not directly interact with DOM-II. Therefore, SM5-1 was further investigated by simulation of its antigen-free state. MD simulations showed that the six residues enhance the stability of the CDR H3 loop (complementarity determining region loop 3 of the heavy chain) by forming an extensive hydrogen bond network at the base region of the CDR H3. Additional MD simulations revealed that mutation of these six residues to match the sequence of less mature antibodies resulted in an almost complete loss of the hydrogen bond network and led to a drastic destabilization of the CDR H3, which explains the lower binding affinity of antibodies lacking the stabilizing residues. This study reveals that somatic mutations can affect the conformational sampling of an antibody thereby modulating antigen-binding affinity. Moreover, modeling of DOM-II flanking regions and subsequent MD simulation showed that the binding mode of SM5-1 to the DOM-II construct in the crystal structure is similar to the binding mode in full-length HCMV gB and should not be hindered by the presence of additional glycans occurring due to glycosylation. The third aspect of the present work focused on the structure and dynamics of the immediate-early protein 1 (IE1) of cytomegaloviruses (CMV), which is one of the first viral proteins expressed upon infection and is essential for efficient HCMV replication. A recently solved crystal structure of the homologous rhesus CMV IE1 (rhIE1) revealed an elongated, all α-helical fold forming homodimers. Interestingly, rhIE1 crystallized in two different dimeric forms, namely an asymmetric and a symmetric dimer. The differences can be ascribed to three slightly different backbone conformations of the monomeric chains occurring in the dimer structures. In the present work, MD simulations of rhIE1 in its two dimeric conformations revealed that the asymmetric dimer was more stable indicating that IE1 has the propensity to form asymmetric protein-protein complexes probably also with other proteins. In addition, further investigation of the interface properties together with the distribution of evolutionary conserved residues imply a monomer-dimer equilibrium for IE1 and suggest an extended interface for interaction with target proteins. MD simulations of the three monomeric forms of rhIE1 detected hinge-like motions, which explain the occurrence of slightly different backbone conformations in rhIE1. In order to study HCMV IE1 (hIE1), a homology model based on rhIE1 was generated and simulated for further optimization in a dimeric and monomeric state. Similar dynamics to rhIE1 were detected for hIE1 indicating the accuracy of the model and a conserved hinge-like motion within the IE1 fold that is likely to be important for its function. Furthermore, a search in the Protein Data Bank did not reveal a significant global fold similarity of IE1 to any other protein rendering it as a novel fold. However, a local structural similarity was found to the evolutionary conserved coiled-coil domain (CCD) of TRIM (tripartite motif family) proteins. PML (TRIM19) is an important cellular target protein of IE1 and also contains this CCD, which was previously shown to be crucial for interaction with IE1. Thus, this computational study provides further insight into IE1 functions and suggests that the detected dynamics of the IE1 fold might enable a better interaction with the elongated, α-helical CCD of PML. Taken together, computational methods, such as MD simulations, applied in this work helped to detect protein dynamics relevant for protein function and emphasize the importance to analyze different conformations and oligomeric states of a protein in order to fully understand its molecular mode of action.Herpesviren befallen sowohl Tiere als auch Menschen und können nach der Erstinfektion lebenslang in ihrem Wirt überdauern. Weltweit treten mindestens fünf humane Herpesviren besonders häufig auf, weshalb die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe zur Eindämmung der Virusverbreitung und zur Behandlung viraler Erkrankungen von herausragender Bedeutung ist. Da solche Wirkstoffe gegen spezifische Proteine des viralen Lebenszyklus gerichtet sind, ist ein detailliertes Verständnis der Funktion der beteiligten viralen Effektorproteine auf molekularer Ebene unabdingbar. Eine statische Proteinstruktur, die durch Röntgenkristallographie erhalten wurde, liefert bereits Einblicke in die Proteintopologie und funktion. Ergänzend zum Laborexperiment stellt die Bioinformatik Werkzeuge zur Verfügung, mit deren Hilfe das dynamische Verhalten eines Proteins untersucht werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden rechnergestützten Methoden angewandt, um die Wechselwirkung herpesviraler Proteine mit Wirtsproteinen bezüglich Rezeptorbindung, Erkennung durch Antikörper und der Bildung von Homo- und Heterodimeren zu untersuchen. Für die Infektion eines Wirts nutzen Herpesviren eine Maschinerie aus Glykoproteinen, um mit der Zielzelle zu fusionieren und die Lipidmembran-Barriere zu überwinden. Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1), welches wässrige Bläschen und Läsionen an Mund und Lippen verursacht, benötigt vier Glykoproteine für die Fusion, darunter auch Glykoprotein D (gD). Auf der Zielzelle erkennt gD zwei strukturell unterschiedliche, zelluläre Rezeptoren: HVEM (herpes virus entry mediatior) und nectin-1. Durch Bindung eines der beiden Rezeptoren löst gD die Fusion aus. Die Rezeptorbindung selbst geht mit intramolekularen strukturellen Umlagerungen in gD einher, welche die Ablösung des C-Terminus oder auch die Ausbildung einer N-terminalen Haarnadelschleife umfassen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene gD-Mutanten untersucht, die die Rezeptoraffinität oder -spezifität beeinflussen, um deren molekularen Wirkungsmechanismus zu charakterisieren. Die durchgeführten Moleküldynamik-Simulationen (MD) zeigten, dass Mutationen nicht nur die gD-Rezeptorbindungsfläche, sondern auch die intramolekularen Umlagerungsprozesse beeinflussen können. Insbesondere die W294A- und die Q27A-Mutante begünstigen das Ablösen des C-Terminus. Darüber hinaus war in den Simulationen zu beobachten, dass die Q27A-Mutation eine korrekte Ausbildung der N-terminalen Haarnadelschleife stört, welche ausschließlich für die Bindung von HVEM benötigt wird. Der Befund, dass eine Q27A-Mutation die Dynamik mehrerer Schritte im Rezeptorbindemechanismus beeinflusst, liefert auf molekularer Ebene eine Erklärung für die erhöhte Nectin-1-Affinität und die ausgeprägte Rezeptorspezifität. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen zusätzlich auf, dass eine alleinige Untersuchung der Bindungsfläche des gD-Rezeptors nicht genügt, um die Effekte neuer Mutationen auf die Rezeptorbindungseigenschaften vorherzusagen. Stattdessen sollten diese Vorhersagen von Mutationseffekten solche Schritte in die Analyse mit einbeziehen, die der gD-Rezeptorbindung vorangehenden. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit neutralisierenden Antikörpern, die gegen Domäne II (DOM-II) von Glykoprotein B (gB) des humanen Cytomegalovirus (HCMV) gerichtet sind. Normalerweise verläuft eine HCMV-Infektion subklinisch, jedoch kann sie eine ernsthafte Bedrohung für immungeschwächte Patienten und Neugeborene darstellen. Da gB das aktive Fusionsprotein in HCMV darstellt, ist hier ein detailliertes Verständnis der Antigenerkennung durch Antikörper von herausragender Bedeutung. Eine kürzlich bestimmte Kristallstruktur des hochaffinen SM5-1-Antikörpers gebunden an ein DOM-II-Konstrukt hat erste Einblicke in wichtige Bestimmungsfaktoren der Antigenbindung gewährt. Vergleicht man SM5-1 mit weniger gereiften Antikörpern, stellt sich allerdings die Frage, wie das Auftreten von somatischen Mutationen eine hundertfach höhere Bindungsaffinität von SM5-1 bewirken kann. MD-Simulationen und anschließende Analysen des SM5-1-DOM-II-Komplexes zeigten, dass sechs Reste, welche spät im somatischen Reifungsprozess in SM5-1 entstehen, nicht direkt mit DOM-II interagieren. Daher wurde SM5-1 mittels Simulationen eines antigen-freien Zustandes weiter untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die sechs Aminosäuren essentiell für die Stabilität der CDR H3-Schleife (complementarity determining region 3 der schweren Kette) sind, indem sie ein umfassendes Netzwerk an Wasserstoffbrücken an der Basis der CDR H3 ausbilden. Zusätzliche Simulationen ergaben, dass eine Mutation dieser sechs Reste zu Aminosäuren, die in unreiferen Antikörpern vorliegen, zu einem fast vollständigen Verlust des Wasserstoffbrücken-Netzwerkes und einer hochgradigen Destabilisierung der CDR H3 führt. Diese Befunde erklären die beobachtete schwächere Bindungsaffinität von unreiferen Antikörpern, denen diese sechs Reste fehlen. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen somit, dass somatische Mutationen einen Effekt auf die Dynamik eines Antikörpers haben können und auf diese Weise auch die Antigenbindungsaffinität modulieren. Zusätzlich ergab die Modellierung von flankierenden Regionen der DOM-II mit anschließender MD-Simulation, dass die in der Kristallstruktur beobachtete Bindung von SM5-1 an DOM-II auch der Bindung an vollständiges gB-Protein ähnlich ist und durch zusätzliche Glykane, die durch Glykosylierungen entstehen, nicht behindert wird. Im dritten Teil der Arbeit steht die Struktur und Dynamik des IE1-Proteins (immediate-early protein 1) des Cytomegalovirus (CMV) im Mittelpunkt, das als eines der ersten Proteine nach CMV-Infektion exprimiert wird und für eine effiziente Virusreplikation essentiell ist. Die kürzlich aufgeklärte Struktur des homologen IE1-Proteins des Rhesus-CMVs (rhIE1) offenbarte eine längliche, α helikale, homodimere Faltung. Interessanterweise kristallisierte rhIE1 in einer symmetrischen und einer asymmetrischen Dimer-Konformation. Die Unterschiede der Dimere können auf drei leicht verschiedene Rückgrat-Konformationen der rhIE1-Ketten zurückgeführt werden, welche in den Dimeren vorliegen. MD-Simulationen der zwei dimeren rhIE1-Strukturen zeigten eine höhere Stabilität der asymmetrischen Konformation. Dies deutet darauf hin, dass IE1 asymmetrische Protein-Protein-Komplexe und damit auch Heterodimere bilden kann. Die weitere Untersuchung der Dimer-Interaktionsflächen und insbesondere die Verteilung evolutionär konservierter Aminosäuren weisen darauf hin, dass IE1 in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht vorliegt und einen großen Bereich zur Interaktion mit Zielproteinen nutzt. MD-Simulationen der drei monomeren rhIE1-Konformationen zeigten eine scharnierartige Bewegung, die das Auftreten der leicht unterschiedlichen rhIE1 Rückgrat-Konformationen in den Kristallen erklärt. Des Weiteren wurde durch komparative Molekülmodellierung auf Basis der rhIE1-Faltung eine HCMV IE1-Struktur (hIE1) generiert und nachfolgend zur Optimierung als Dimer und Monomer simuliert. Die hIE1-Struktur zeigte hierbei eine ähnliche Dynamik wie rhIE1, was für die Richtigkeit des Modells und eine konservierte Scharnierbewegung in der IE1-Faltung spricht, welche somit wichtig für die Funktion von IE1 sein könnte. Außerdem ergab eine Suche in der Proteinstruktur-Datenbank (PDB) keine Ähnlichkeit der Gesamtfaltung zu anderen Proteinen; die IE1-Faltung ist damit völlig neu. Allerdings konnte eine in Abschnitten strukturelle Ähnlichkeit zur evolutionär konservierten CCD (coiled-coil domain) von TRIM-Proteinen (tripartite motif familiy) gefunden werden. Interessanterweise enthält PML (promyelocytic leukemia protein), welches zur TRIM-Familie gehört und ein wichtiges Zielprotein von IE1 darstellt, auch eine CCD, die in vorangegangen Experimenten als essentiell für die Wechselwirkung mit IE1 identifiziert wurde. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben somit einen tieferen Einblick in die Funktion von IE1 und deuten darauf hin, dass die beobachtete Dynamik von IE1 eine bessere Interaktion mit der länglichen, α-helikalen CCD von PML bewirken kann. In der vorliegenden Arbeit konnte mit computergestützten Methoden das dynamische Verhalten von Proteinen simuliert und analysiert werden, welches für deren Funktion eine wichtige Rolle spielt. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass unterschiedliche Konformationen und Oligomerisierungszustände sowie die Flexibilität eines Proteins untersucht werden müssen, um dessen molekulare Wirkungsweise vollständig zu verstehen