Rechnergestützte Methoden zur Analyse und Simulation von regulatorischen Netzwerken im Hochdurchsatz in der Neurobiologie

Background and goals: The development of a healthy and functional central nervous system (CNS) is a complex process that starts during embryogenesis and requires a precise orchestration of the differentiation of several cell types both in time and space. Oligodendrocytes (OLs) are glial – or non-neuronal – cells that originate from the same stem cells from which neurons are generated though responding to a different combination of specific molecular cues, and their first appearance is temporally located after the development of the first neurons to support and protect their extensions (axons). In fact, the primary function of OL cells is to envelope the neuronal axons with multiple layers made up of myelin proteins and lipids. This process is also known as myelinogenesis and myelination. Any alteration in the development of OLs has the potential to severely compromise myelinogenesis and therefore, the health of the entire CNS by causing the onset of pathological conditions like dysmyelination or demyelination. In myelination-related diseases, the more advanced investigations propose to use the transplantation of pluripotent stem cells and their stimulation so to drive them towards OL lineage for replenishing the defective or lacking native OL population. Clinical investigations applying such methods showed an actual improvement in patients’ conditions. However, these approaches come with potentially side effects: in some cases, it has been observed that the transplanted cells developed to tumor-like cells or into cells belonging to lineages other than OLs. In order to avoid this potential danger and to develop healthy and fully functional OLs capable of sustaining myelinogenesis, it is of importance to deepen the knowledge about the oligodendrogenesis in physiological conditions. Differentiation is a biological process that requires the coordination of a vast biochemical network including numerous molecular compounds like transcription factors (TFs) and miRNAs, and their reciprocal regulatory interactions are highly intricated and dynamically evolve along the course of differentiation. Instead of observing OLs differentiation by focusing on the activity of a single or a small group of molecules, a more systematic approach has been applied in this thesis. More precisely, a combination of high throughput data (HTD) analysis, bioinformatics, network analysis, mathematical optimization and modeling approaches has been applied in the specific neurobiological context of OLs differentiation. One could redefine the method used as systems neurobiology, an approach distinct from the more traditional computational neuroscience. In this thesis, the methodology is applied to two case studies to unveil regulatory events driving OLs differentiation and to illustrate OLs differentiation from a more systemic and inclusive perspective. Methods: In the first case study, the focus was around the reciprocal influence of two TFs (Sox9 and Sox10) and their contribute to oligodendrogenesis. A combination of HTD, network biology, bioinformatics and modeling methods has been applied to identify a small regulatory loop including the afore mentioned TFs Sox9 and Sox10 together with two miRNAs (miR-335 and miR-338). In the second case study, an extended regulatory network including few molecules has been manually generated and then further extended using high throughput sequencing data (ChIP-Seq and RNA-Seq), literature research, and information from publicly accessible databases. In a second step, network analysis procedures were applied to identify subnetworks and network motifs showing a higher activity along OLs differentiation process. For prioritizing the identified regulatory motifs, an optimization function has been implemented, and the motifs have been evaluated by considering expression and topological data. Additional analyses of the top ranked loops show a higher frequency of motifs containing a small group of three TFs, which pointed to the possibility that these regulators play a leading role in the OLs differentiation process. The next step focused on the definition of a mathematical model of molecular interactions capable of reproducing OLs differentiation. The model has been constructed based on the results of the network analysis procedures. Inconsistencies between the initial results of the simulations and literature suggest that the model lacked relevant molecular interactions, and data-driven bioinformatics procedures were applied to unveil novel regulatory reactions allowing to match data to computational predictions. Results and observations: In the first case study, systematic simulations of the obtained mathematical model recapitulated the role of the motif in modulating the migration behavior of OL precursors (OPCs). Further simulations and experimental assays confirmed the structure of the loop as well as the relation between the expression variation induced by the regulatory loop and the migration potential of OPCs. In the second case study, the main results consisted in (i) the identification of networks describing OLs differentiation with different complexity levels, (ii) the proof that networks contains nested motifs responsible of the fine tuning of OLs differentiation, and (iii) the definition of a mathematical model recapitulating the OLs differentiation in the first and second wave of differentiation. The elements and the interactions included in the model were based on network analyses and bioinformatics procedures, and the in silico predicted interactions were experimentally validated. Conclusions: The extent of the topics covered by neuroscience, the innate complexity of the field, and the significant amount of available data make up a perfect scenario for the application of a multidisciplinary approach such as the one proposed by systems biology. Furthermore, the integration of more modern techniques like bioinformatics and network analysis with more traditional methods of investigation aims to offer a novel and more systemic point of view for investigating the differentiation of neural cells. The method has the potentiality to support the design of new experiments. In this thesis, the combination of the afore mentioned methodologies supported the prediction of novel TF-miRNA and miRNA-mRNA interactions as well as their experimental validation. Model simulations were further used to recapitulate existing data and develop a mechanistic hypothesis for OLs differentiation. All these evidences support the power and the validity of the application of this interdisciplinary approach in neuroscience.Hintergrund und Ziele: Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Diese Zellen sind heterogen zwischen weißer und grauer Substanz verteilt und ihre Hauptfunktion besteht in der Sekretion von Myelinproteinen, um Schutzhüllen um neuronale Axone zu bilden. Diese Funktion tritt erst auf, wenn die OLs vollständig ausgereift und differenziert sind. Die OLs-Differenzierung (Oligodendrogenese) ist gekennzeichnet durch eine Reihe von streng regulierten biochemischen Ereignissen, die die Morphologie und das Verhalten der differenzierenden Zellen verändern. Die Abfolge der Reaktionen wird durch ein breites Netzwerk von Molekülen fein orchestriert, die in hochgradig miteinander verbundenen Signaltransduktionswegen organisiert sind. Innerhalb solcher regulatorischen Pfade spielen Transkriptionsfaktoren (TFs) eine entscheidende Rolle. Diese sind Proteine, die biochemische Reaktion beeinflussen, indem sie die Transkription vieler Zielgene fördern oder hemmen. Darüber hinaus regulieren microRNAs (kleine nicht-kodierende RNAs von etwa 20-25 Nukleotiden) die Expression, indem sie an transkribierte mRNAs binden und deren Translation verhindern. Der Expressionsgrad von miRNAs und TFs variiert während der Oligodendrogenese und solche Schwankungen beeinflussen den Zeitpunkt des Differenzierungsprozesses. Aufgrund der großen Datenmenge und der hohen Anzahl von Interaktionen zwischen den Molekülen zeichnet sich die Systembiologie durch den integrativen Ansatz aus, der Datenanalyse, molekulare Netzwerke und mathematische Modellierung kombiniert, um die Dynamik des zugrunde liegenden regulatorischen Netzwerks zu untersuche und zu emulieren. Dank der systemischen Perspektive ist es so möglich, die Differenzierung von OLs in Bezug auf ein breites Reaktionsnetzwerk zu untersuchen. OLs haben eine einzigartige Funktion im CSN, daher kann jede Bedrohung für die OL-Population unter schweren pathologischen Bedingungen, die das Individuum ein Leben lang betreffen, potenziell degenerieren. Die wichtigsten Myelin-Dysfunktionen werden in Dysmyelinisierung (Scheitern der Myelinogenese, pränatal) und Demyelinisierung (fortschreitender Verlust der Myelinscheiden, postnatal) unterteilt. Obwohl makroskopische Ähnlichkeiten und Symptome bestehen, unterscheiden sich die beiden Zustände hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf biochemische Pfade erheblich. Derzeit wird die Zelltransplantation von undifferenzierten OLs aktiv als mögliche Heilung für myelinbedingte Pathologien untersucht. Es hat sich gezeigt, dass OL-Vorläufer ein Migrations- und Proliferationspotenzial besitzen, das größer ist als bei reifen OLs, weshalb sie für die Transplantation bevorzugt werden. Tatsächlich berichten Studien, dass OLs-Vorläufer Läsionen, die durch Multiple Sklerose im ZNS verursacht werden, besiedeln und reduzieren. Trotz der Vorteile sind Risiken mit der Implantation undifferenzierter heterologer Zellen verbunden: Es wurde beobachtet, dass sich stammartige Zellen in eine andere Zelllinie (häufig Astrozyt) oder noch schlimmer in eine tumorerzeugende Zelle differenzieren können. Es ist dann von großer Bedeutung zu wissen, wie man die sichere Reifung der transplantierten Zellen zu funktionellen OLs lehnen kann, um ein beschädigtes ZNS zu reparieren. In dieser Arbeit, das primäre Ziel war die Vertiefung der Kenntnisse der physiologischen OLs Differenzierung zur Unterstützung der Entwicklung von fortgeschritteneren und präziseren therapeutischen Ansätzen in der Zukunft. Methoden: Die hohe Komplexität der Oligodendrogenese beruht nicht auf der unabhängigen Aktivität einzelner Moleküle, sondern auf deren Wechselwirkungen. Daher verwendet die implementierte Methodik Hochdurchsatzdaten (HTD) wie TLDA-Microarray und RNA-Seq, um die Variation der Expression einer größtmöglichen Anzahl von Molekülen während der Oligodendrogenese zu berücksichtigen, und ChIP-Seq, um unveröffentlichte TF-Zielgen-Interaktionen einzubeziehen. Neben der klassischen Herangehensweise der Systembiologie, werden in dieser Arbeit neue bioinformatische Algorithmen zur Bewertung neuer miRNA-mRNA-Interaktionen vorgestett. Einige der neuartigen miRNA-mRNA- und TF-Zielgen-Interaktionen konnten später experimentell validiert werde. Der erste Schritt der Methodik bestand in der Konstruktion eines molekularen Netzwerks. Moleküle und Interaktionen wurden auf der Grundlage von Literaturwissen, Datenbankeinträgen in das Network eingebenden. Zusätzlich wurde neue Interaktionen basierend auf ChIP-Seq-Ergebnissen und bioinformatisch vorhergesagten miRNA-mRNA-Duplexen aufgenommen. Für literaturbasierte Netzwerke wurden Knoten und Interaktionen manuell hinzugefügt und kommentiert, wobei Python-Scritps implementiert wurden, um die Netzwerke mit Datenbank- und HTD-Kenntnissen zu erweitern. Bei der Einbindung neuer miRNA-mRNA-Interaktionen, wurden bioinformatische Algorithmen angewandt und die Ergebnisse verglichen, um die Stabilität des Duplexes und damit seine tatsächliche Bildung in vivo/in silico zu beurteilen. Um die Netzwerkgröße zu verdichten, wurde die Anzahl der Interaktionen und Moleküle durch sequentielle Filterschritte basierend auf Genexpression und Kontextualisierung bis hin zur Oligodendrogenese reduziert. Nach der Uberprüfung des gestutzten Netzwerks auf spezifische Motivstrukturen, wurde eine Optimierungsmethode implementiert, um die identifizierten Motive durch die Kombination topologischer und biologischer Daten zu bewerten. Für die Analyse der Aktivität zentraler Regelkreise in silico, wurde ein mathematisches Modell an die gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODE) mit zunehmender Komplexität erzeugt und simuliert. Modellparameter wurden systematische variiert, um Rüchsschlüssee Eigenschaften des Systems und ihre biologischen Auswirkungen zu untersuchen. Ergebnisse und Beobachtungen: In der ersten hier vorgestellten Fallstudie ging es darum zu untersuchen, ob Sox10- und Sox9-TFs den Expressionsgrad des jeweils anderen beeinflussen können. Das Netzwerk und die gesammelten Daten zeigten die Existenz eines Regelkreises, der durch miRNA-338 und miRNA-335 vermittelt wurde, und das entsprechende mathematische Modell reproduzierte die in den experimentellen Daten beobachteten Expressionsspitzen. Darüber hinaus beschränkte die simulierte Dynamik das Migrationspotenzial des OL-Vorläufers auf den Zeitrahmen der Sox10-Sox9-Koexpression. Systematische Variationen der Modellparameter zeigten die Existenz eines biologischen Schalters: Sobald Sox10 eine Expressionsschwelle überschreitet, wird die Oligodendrogenese irreversibel. In der zweiten Fallstudie war es das Ziel, das Wissen über das regulatorische Kernnetzwerk, das die OLs-Differenzierung moduliert zu erweitern und die unterschiedlichen embryonalen Wellen der Oligodendrogenese zu untersuchen. Ein erstes Ergebnis ist die Erzeugung von drei annotierten molekularen Netzwerken, die die Differenzierung von OLs beschreiben. Die drei Netzwerke zeigen eine zunehmende Komplexität. Analysen zur Identifizierung und Rangfolge von Netzwerkmotiven zeigten eine relevante Beteiligung von Olig2, Sox10 und Tcf7l2 TFs an Regelkreisen und deuteten damit auf ihre zentrale Rolle bei der Oligodendrogenese hin. Die mathematische Modellierung zeigte, dass Paare der oben genannten TFs, die jeweils gemeinsame Ziele haben Familien von regulatorischen Motiven darstellen, die in verschiedenen Phasen der Oligodendrogenese aktiv sind. Diese Erkenntnis stärken die Rolle der TFs als Teil der Schlüsselregulation der OL-Differenzierung. Anschließend werde ein erweitertes Modell, erstellt das die Neuralrohrreize von ventralen Sonic Hedgehog- und dorsalen Bone Morphogenic Proteinen, neuartigen miRNA-mRNA- und TF-Zielgen-Interaktionen, berücksichtigen. Simulationen, die den Konzentrationsgradienten der morphogenen Reize entlang der dorso-ventralen Achse reproduzierten, bewiesen, dass zwei differenzierende OLs-Wellen trotz des unterschiedlichen Auslösers, Zeitpunkts und der Position im Neuralrohr vom gleichen regulatorischen Kern gesteuert werden. Parallel dazu wurde ein zweites mathematisches ODE-Modell implementiert, um die fortschreitende Differenzierung von OLs-Vorlägen zur reifen und myelinisierenden OLs-Population qualitativ zu beschreiben. Parallele simulationen des zellulären und biochemischen Modells der Reizgradienten der Neuralröhre zeigten, dass verschiedene Kombinationen von Reizen von Morphogenen die Oligodendrogenese einleiten können (jeweils entsprechend der verschiedenen Abschnitte der Neuralröhre) und dass der Differenzierungsprozess einen bistabilen Schalter darstellt. Genauer gesagt, kann die terminale Differenzierung nur erreicht werden, wenn präzise Expressionsmuster in neuronalen Stammzellen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Simulationen deuten darauf hin, dass ein erstes Muster der ventralen pMN-Domäne entspricht, aus der die primäre Oligodendrogenese auftritt, und ein zweites Muster den dP3-dP6 medio-dorsalen Domänen, aus denen die sekundäre Oligodendrogenese beginnt. Die im Modell enthaltenen neuartigen Wechselwirkungen zwischen miRNA-mRNA und TF-Zielgenen konnten experimentell validiert werde. Schlussfolgerungen: Diese Arbeit zeigt, dass ein integrativer Ansatz in der Neurobiologie ein höheres Potenzial hat, in neuen Erkenntnissen zu kommen als die unabhängige Anwendung von in silico oder in vivo/in vitro Methoden und Techniken. Da der Schwerpunkt auf der Aufklärung molekularer Mechanismen liegt, die die Oligodendrogenese regulieren, wurde eine systembiologische Methode angewandt, um den Differenzierungsprozess von OLs aus einer eher systemischen Perspektive zu beobachten. Die Integration von HTD-Analysen mit bioinformatischen Methoden, führte zur in silico Identifizierung molekularer Wechselwirkungen, die später in vitro validiert wurden. Mathematische Modellierung der Dynamik von Regelkreisen rekapituliert und erklärt Daten qualitativ aus Datenbanken und Literatur. Die Anwendung der Systembiologie in den Neurowissenschaften steht am Anfang, und die große Menge an verfügbaren Daten zusammen mit der Komplexität des Themas macht dieses Feld perfekt für einen integrativeren und systemischeren Ansatz. Therapien für neurologische Pathologien wie Dysmyelinisierung, Demyelinisierung oder andere, die mit Schäden oder Beeinträchtigungen der Oligodendrogenese einher gehen sind, können einen neuen Schub durch die neuen Erkenntnisse und Perspektiven der Systemneurobiologie finden