Proteomic analysis of disease associated changes in animal models of dilated cardiomyopathy

Dilatative Kardiomyopathie ist eine Erkrankung, die durch einen progressiven Verlust der kontraktilen Funktion und einer Vergrößerung des linken Ventrikels gekennzeichnet ist. Die damit einhergehenden Fehlfunktionen des Herzens stellen den Grund für eine Herztransplantation dar. Neben genetischen Ursachen spielen auch virale Infektionen sowie die Autoimmunantwort eine Rolle in der Ätiologie der Erkrankung. Unter den Viren, die eine derartige Erkrankung hervorrufen, sind vorwiegend Coxsackie B3 Viren (CVB3) mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Erkrankung assoziiert. Die durch Coxsackie-Viren in Mäusen induzierte Myokarditis bildet das Krankheitsbild der humanen Myokarditis und dilatativen Kardiomyopathie ab. In diesem Tiermodell entwickelt sich innerhalb von 90 Tagen nach Infektion zunächst eine akute Myokarditis, die in ein chronisches Krankheitsbild übergeht und sich zu einer dilatativen Kardiomyopathie sowie kongestiver Herzfehlfunktion manifestiert. Obwohl inzwischen zahlreiche Informationen zum Fortschreiten der Erkrankung bekannt sind, ist das Verständnis zu den molekularen Hintergründen immer noch unzureichend. In der vorliegenden Arbeit wurden vergleichende Proteomanalysen von Herzen aus A.BY/SnJ-Mäusen 84 Tage nach Infektion (84 d p.i.) mit CVB3 und Herzen aus gleichalten nichtinfizierten Mäusen durchgeführt. Zur Charakterisierung der Änderungen auf Proteinebene wurden 2D-DIGE und gelfreie LC-MS/MS als Methoden genutzt und die Ergebnisse mittels Western Blot und Immunohistochemie validiert. Insgesamt wurden 101 verschiedene Proteine identifiziert, die in den Herzen mit CVB3 infizierter A.BY/SnJ-Mäuse (84 d p.i.) im Vergleich zu gleichalten Kontrollen Veränderungen zeigten und mit dilatativer Kardiomyopathie assoziiert sind. Die umfassende Analyse durch DIGE und gelfreie Proteomics zeigte, dass in den Herzen erkrankter Tiere vor allem Proteine des Lipidstoffwechsels (18 %), des Kohlenstoffwechsels (14 %), der Zellmorphogenese (14 %) und der respiratorischen Elektronentransportkette signifikante Veränderungen in der Menge aufwiesen. Der erhebliche Anstieg des Levels extrazellulärer Matrixproteine in Herzen infizierter Mäuse (84 d p.i.) ist Hinweis auf eine extensive Fibrose. Auf der anderen Seite wurden zum Energiestoffwechsel gehörende Proteine in geringerer Menge in den Herzen infizierter Mäuse im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen. Aus diesen Proteomdaten wie auch den gemessenen geringeren Aktivitäten der Komplexe I-IV der Elektronentransportkette in A.BY/SnJ-Mäusen (84 d p.i.) im Vergleich zu Kontrollen, kann auf eine verminderte Energieversorgung in dilatierten Herzen geschlossen werden. Außerdem wurden auch Proteine, die an der Muskelkontraktion beteiligt sind, in Herzen infizierter Tiere in geringerer Menge gefunden, woraus auf eine Beeinträchtigung der myokardialen Kontraktion bei virus-induzierter dilatativer Kardiomyopathie geschlussfolgert werden kann. Die Änderungen bei den extrazellulären und kontraktilen Proteinen wurden durch die DIGE Analyse erfasst. Dagegen konnten die Änderungen bei Proteinen des Lipidstoffwechsels, die vornehmlich in den Mitochondrien lokalisiert sind und einen pI > 7 aufweisen durch die gelfreie Proteomanalyse aufgezeigt werden, was auch den Vorteil der Verwendung beider Methoden zeigt. Die gelbasierte Analyse unterstützt die Identifikation von Proteinisoformen und –spezies, die Rückschlüsse auf posttranslationale Modifikationen bzw. die Proteinprozessierung zulassen. So konnten im Rahmen der Arbeit mit der Infektion verbundene Änderungen in der Phosphorylierung einzelner Proteine nachgewiesen werden. Die phosphospezifische Färbung der Gele zeigte eine Zunahme der Phosphorylierung in infizierten Herzen sowohl für die ventrikuläre Form der regulatorischen leichten Myosinkette, wie auch Aktin (Isoform des glatten Muskels) und den Hitzeschockproteinen 90B und Beta-1. Ein Abbau von Proteinen wurde in den dilatierten Herzen nicht beobachtet. Wie zuvor schon erwähnt, verläuft die Entwicklung der dilatativen Kardiomyopathie im murinen Tiermodell über einen Zeitraum von 90 Tagen, in denen die Mäuse sich entwickeln und auch altern. Da auch das Alter ein Faktor ist, der die Empfänglichkeit der Tiere für Krankheiten beeinflusst, wurden auch die durch Alterungsprozesse hervorgerufenen Veränderungen im Herzen von 4 Monate alten Tieren im Vergleich zu 1 Monat alten Kontrolltieren untersucht. Die komplementäre Analyse des Proteomes durch 2D-DIGE und gelfreie LC-MS/MS ergab 96 verschiedene Proteine, die altersassoziierte Änderungen aufwiesen und dem Lipidmetabolimus (19 %), dem Proteintransport (17 %) und der Elektronentransportkette zuzuordnen sind. Die in den Lipidstoffwechsel und Transport involvierten mitochondrialen Proteine Carnitin-o-palmitoyltransferase 1 und 2 sowie die Carnitin-O-acetyltransferase zeigten signifikant höhere Level in 4 Monate alten Tieren. Offenbar liegt in älteren Tieren ein höherer Energiebedarf vor, der auch durch die beobachteten niedrigeren Spiegel an Proteinen der respiratorischen Atmungskette, speziell der Untereinheiten der ATP- Synthase (Komplex V) mit verursacht sein kann. Weiterhin wurde in 4 Monate alten Tieren eine Zunahme der Menge von Proteinen, die am intrazellulären Transport beteiligt sind, beobachtet. Der erhöhte Spiegel an vesikulären Transportproteinen stellt wahrscheinlich einen sekundären Effekt dar, der zu einer mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziierten Proteinabbau führt. In den zwei zuvor beschriebenen Studien wurden wesentliche Änderungen in der mitochondrialen Funktion und damit verbunden eine verminderte Energie-/ATP-Produktion beobachtet, was die Rolle der Mitochondrien in Gesundheit und Krankheitsentwicklung unterstreicht. Der Austausch von ADP/ATP entlang der mitochondrialen Membran erfolgt durch das Transportprotein Adeninnukleotidtranslocase 1 (ANT1). Um die Bedeutung von ANT1 im Herzen besser zu verstehen, wurden mittels LC-MS/MS Proteomanalysen von Herzen 3 Monate alter ANT1-überexpremierender Ratten im Vergleich zu Organen aus gleichalten Wildtyptieren durchgeführt. Insgesamt wurden 433 Proteine anhand von mindestens 2 Peptiden identifiziert, von denen 87 geringfügige, aber signifikante Änderungen in der Intensität aufwiesen. Proteine des Integrin-vermittelten Kinase-Signalweges sowie an der myokardialen Kontraktion beteiligte Proteine waren abundanter in Herzen der ANT1-überexprimierenden Ratten, während Proteine der mitochondrialen Atmungskette im Vergleich zu Wildtyptieren geringere Level zeigten. Mittels Oxyblotanalysen konnte nachgewiesen werden, dass kein Unterschied in der Proteinoxidation im Herzen zwischen transgenen und Wildtyptieren besteht. Um den Einfluss der ANT1-Überexpression im Verlauf einer Virus-induzierten dilatativen Kardiomyopathie zu verstehen, wurden vergleichende Proteomanalysen auch für mitochondriale Fraktionen 8 Monate alter Ratten des Wildtyps und ANT1 transgener Tiere nach CVB3 Infektion durchgeführt. Von 370 identifizierten Proteinen wiesen 83 unterschiedliche Mengen in Herzen von Wildtyptieren und transgenen Tieren auf. In infizierten transgenen Tieren wurden vor allem geringere Mengen für Proteine der mitochondrialen Elektronentransportkette, des Fettstoffwechsels sowie an der Kontraktilität und der Zellstruktur beteiligter Proteine gemessen, so dass von einer Beeinträchtigung dieser Zellfunktionen in transgenen Tieren im Vergleich zu Wildtyptieren ausgegangen werden kann. Neben den viralen Infektionen spielt auch die Autoimmunantwort eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Myokarditis und dilatativer Kardiomyopathie. Daher wurden auch Proteomanalysen für ein experimentelles Tiermodell durchgeführt, bei dem in Ratten durch die aktive Immunisierung mit Peptiden des FcγIIa- Rezeptors -CEPPWIQVLKEDTVTL (Peptid 1) benannt als FcR- Tiere und CRCRMEETGISEPI (Peptid 2) –als FcR2-Tiere bezeichnet- eine autoimmun- vermittelte Myokarditis induziert wird. Von den 303 mittels LC-MS/MS anhand von mindestens 2 Peptiden identifizierten Proteinen wiesen 43 bzw. 49 höhere Intensitäten (>1,2 fach) in Herzen von FcR-Tieren bzw. von FcR2-Tieren im Vergleich zu Herzen von mit Adjuvans KLH behandelten Kontrolltieren auf. Die Mehrheit der Veränderungen (>70%) wurde in beiden Autoimmunmodellen gleichermaßen beobachtet. So führte die Immunisierung in beiden experimentellen Modellen zu einer akuten-Phase-Antwort. Außerdem weist die Anreicherung der Proteine Lumican und Procollagen I alpha auf eine verstärkte Fibrose in den Herzen nach Immunisierung hin, unabhängig davon, welches Peptid eingesetzt wurde. Insgesamt konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Proteomicsmethoden die Veränderungen im kardialen Proteinprofil in zwei Tiermodellen für die dilatative Kardiomyopathie – der Virus-induzierten und der autoimmun-induzierten dilatativen Kardiomyopathie - in Maus- und Rattenmodellen für diese Erkrankung charakterisiert werden. 2D-DIGE und die gelfreie LC-MS/MS sind komplementäre Techniken, die einen umfassenden Einblick in die Änderungen im Proteinprofil der Herzen der verschiedenen Tiermodelle ermöglichen. Das Virus-induzierte Modell der Kardiomyopathie wird dominiert durch eine veränderte mitochondriale Funktion, die zu einer Einschränkung des Energiestoffwechsels sowie einer Beeinträchtigung der myokardialen Kontraktilität führt, während die autoimmun-induzierte Kardiomyopathie eher durch eine Akute-Phase-Antwort charakterisiert wird. Änderungen der Mitochondrienfunktion wurden auch mit dem Alterungsprozess assoziiert in A.BY/SnJ Mäusen beobachtet und unterstreichen die Bedeutung der Mitochondrien für den Gesundheitszustand von Individuen.Dilated Cardiomyopathy is a chronic myocardial disease characterized by progressive depression of contractile function and ventricular dilatation. It is the leading cause of heart failure and the most common reason for heart transplantation. Besides genetic causes, viral infection and autoimmune response are considered to play a major role in the etiology of the disease. Among different viruses that cause the disease, Coxsackievirus B3 (CVB3) is predominantly associated with the development and progression of the disease. Moreover, Coxsackievirus induced myocarditis in the mouse mimics human myocarditis and dilated cardiomyopathy. In the murine model, the disease progresses over a period of 90 days from acute myocarditis to chronic myocarditis and further develops into dilated cardiomyopathy and congestive heart failure. Though much is known about the progression of the disease, the molecular events occurring after infection with CVB3 are not completely understood. In the current study, comparative proteomic analysis of A.BY/SnJ mouse hearts 84 days post infection (84 d p.i.) with CVB3 and age-matched non-infected mouse hearts was performed. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS were used to characterize the changes occurring at the molecular level and Western Blot analysis as well as immunohistochemical staining was carried out for validation of results. A total of 101 distinct proteins were identified as displaying dilated cardiomyopathy-associated changes in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls. Comprehensive analysis by both DIGE and gel-free proteomics revealed proteins related to lipid metabolism (18%), carbohydrate metabolism (14%), cell morphogenesis (14%) and respiratory electron transport chain (9%) to display significantly altered levels in diseased mouse hearts. The significant increase in extracellular matrix proteins observed in mouse hearts 84 d p.i. indicated extensive fibrosis. On the other hand, proteins related to energy metabolism were identified at lower levels in infected mouse hearts than in controls. These proteomics data and the decrease in activities measured for complexes I-IV of the respiratory electron transport chain in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i compared to age matched controls, indicate a diminished energy supply in the dilated hearts of CVB3 infected mice. Furthermore, proteins associated with muscle contraction were identified at lower levels in mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls indicating compromised myocardial contractility due to virus induced dilated cardiomyopathy. While extracellular matrix proteins and contractile proteins were identified in the DIGE analysis, proteins of lipid metabolism which are mostly mitochondrial in origin and have a pI > 7 were identified by gel-free proteomics indicating the advantages of both methods. Gel based analysis also aided in the identification of protein isoforms/ species which allows conclusions on post translational modifications and protein processing. Thus, the current study also identified infection related changes in the phosphorylation of selected proteins. Phosphospecific staining of the gels demonstrated increased phosphorylation of myosin regulatory light chain - ventricular isoform, actin - aortic smooth muscle isoform, heat shock protein 90B, and heat shock protein beta-1 in infected mouse hearts. Extensive degradation of proteins was not observed in the dilated heart. As described earlier, virus induced dilated cardiomyopathy develops over a period of 90 days in the murine model during which the mice also grow and undergo aging. Since aging is one of the factors influencing the susceptibility of animals to disease, age dependent changes in the proteome of mouse hearts were also studied by comparing 4 months old (84d) A.BY/SnJ mice with 1 month old mice as controls. Complementary analyses by 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis revealed 96 distinct proteins displaying age associated differences in intensity. These proteins are related to lipid metabolism (19%), protein transport (17%) and electron transport chain (12%). Mitochondrial proteins such as carnitine-o-palmitoyltranferase 1, carnitine-o-palmitoyltranferase 2, and carnitine-O-acetyltransferase involved in lipid metabolism and transport were identified at significantly higher levels indicating higher energy demand in 4 months old mice compared to controls. This conclusion is complemented by observation of decreases in the levels of respiratory electron transport chain proteins especially of subunits of ATP synthase as a member of complex V. Furthermore, an increase in intracellular transport proteins was also observed in 4 months old mouse hearts compared to one month old controls. An increase in the level of vesicular transport proteins likely constitutes a secondary effect leading to endoplasmic reticulum associated protein degradation. In the two studies described above, altered mitochondrial functioning and thereby decreased energy/ATP production was very prominent indicating the role of mitochondria in health and disease. The exchange of ADP/ATP across the mitochondrial membrane is carried out by the carrier protein adenine nucleotide translocase1 (ANT1). To improve understanding of the influence of ANT1 in the heart, comparative proteomic analysis using gel-free LC-MS/MS was performed with hearts of 3 months old rats over-expressing ANT1 using hearts from age-matched wild type animals as controls. A total of four hundred and thirty three proteins were identified with at least two peptides, of which eighty seven proteins displayed small but significant (p70%) were observed in both autoimmune models. Thus, immunization leading to an induction of the acute phase response signalling was observed in both experimental setups. Furthermore, the increased amount of proteins such as lumican or procollagen alpha 1, type 1 indicated the presence of fibrosis after immunization independent of the peptide used. In summary, using proteomics the current thesis addresses the changes in protein profiles of two models of dilated cardiomyopathy, namely, virus induced dilated cardiomyopathy and autoimmunity induced dilated cardiomyopathy in mouse and rat models of disease. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis are complementary techniques which provided a comprehensive view of the changes in the protein profile of hearts of the different animal models. Altered mitochondrial function resulting in decreased energy metabolism and compromised myocardial contractility were prominent in viral models of cardiomyopathy whereas intense acute phase response signalling was observed as a characteristic feature of autoimmune dilated cardiomyopathy. Altered mitochondrial function was also prominent in age associated changes in the heart of A.BY/SnJ mice indicating the role and influence of mitochondria in health and in disease