Metabolic aspects of host pathogen interactions revealed by metabolomics

Interaktionen zwischen Bakterien und dem menschlichen Körper finden ständig und in großer Vielzahl statt. Weite Teile der Haut und des Gastrointestinaltraktes, Speichel, orale Schleimhäute, Bindehaut sowie vaginale Schleimhäute sind besiedelt mit einer Vielzahl von Bakterien, der sogenannten Normalflora. Insgesamt wird geschätzt, dass die bakterielle Zellzahl im Körper die des Menschen um ein 10-faches übersteigt. Die meisten Bakterien besiedeln den Menschen jedoch ohne größere Auswirkungen und werden als Kommensale bezeichnet. Bei 25 % bis 30 % der Menschen ist das Gram positive Bakterium Staphylococcus aureus Teil der Normalflora. Allerdings ist S. aureus ein sogenannter opportunistischer Pathogen und kann bei immungeschwächten Menschen Lungen-, Haut- und Herzmuskelinfektionen hervorrufen. S. aureus sekretiert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, die auf verschiedene Arten mit dem Wirt interagieren. Sie machen das Bakterium dem Immunsystem des Wirtes unzugänglich, greifen die Integrität der Wirtszellmembran an und bauen wirtseigene Makromoleküle ab um Nährstoffe für S. aureus bereitzustellen. Des Weiteren ist S. aureus in der Lage Wirtszellen zu infizieren und sich intrazellulär zu vermehren. Diese pathogenität-vermittelnden Eigenschaften machen, in Kombination mit der starken Verbreitung von Antibiotika-resistente Stämmen, S. aureus zu einem der weitverbreitetsten Krankenhauskeime. Das Gram negative Proteobakterium Burkholderia pseudomallei gehört nicht zur Normalflora des Menschen, ist aber in der Lage diesen bei Zugang über Körperöffnungen oder Wunden zu infizieren. Durch seine Eigenschaft, sehr effizient in Wirtszellen einzudringen und intrazelluläre wirtseigene Strukturen zur Verbreitung zu nutzen, verläuft die durch B. pseudomallei verursachte Erkrankung „Melioidose“ oft schwerwiegend bis tödlich. Da das Bakterium natürlicherweise in wässrigen Böden vorkommt, erfordert der Umgebungswechsel nach Infektion eine hohe Anpassungsfähigkeit des Keims. Eine Besonderheit von B. pseudomallei ist die Veränderung seiner Kolonieform auf Festagar in Abhängigkeit von äußeren Faktoren wie Temperatur, pH, Nahrungsverfügbarkeit oder Antibiotikabehandlung. Es wird angenommen, dass Veränderungen der Koloniemorphologie eine Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen darstellt. Das Immunsystem des Menschen verfügt über Abwehrmechanismen um bakterielle Krankheitserreger unschädlich zu machen. Auf molekularer Ebene werden bakterielle Strukturen erkannt und durch die Sekretion von antimikrobiellen Proteinen und mittels reaktiver Sauerstoff- und Stickoxid-Radikale abgetötet. Diese Aktionen und Reaktionen auf beiden Seiten werden als Wirts-Pathogen-Interaktionen zusammengefasst. Das Forschungsfeld der Funktionellen Genomforschung hat in der Vergangenheit Methoden bereitgestellt um verschiedene Ebenen dieser Wirts-Pathogen Interaktionen zu verstehen. Durch die ganzheitliche Analyse der vorhandenen mRNA (das Transkriptom) oder der translatierten Proteine (das Proteom) konnten bereits auf Wirts- und Erregerseite entscheidende zelluläre Prozesse aufgeklärt werden. Hingegen ist die Ebene der Stoffwechselprodukte, der Metabolite, in Bezug auf Wirts-Pathogen Interaktionen bisher weitgehend unbeachtet geblieben. In dieser Dissertation wurden Zusammensetzungen von Metaboliten sowohl im intrazellulären Kompartiment von Wirt und Erreger als auch im Medium, in welchem die Organismen kultiviert wurden, untersucht. Dabei wurden biochemische Analyserverfahren wie 1H-Kernspinmagnetresonanzspektroskopie und chromatographische Trennverfahren in Verbindung mit Massenspektrometrie verwendet um möglichst umfassende Informationen über die Metabolitenzusammensetzung und deren Konzentration zu bekommen. In Analogie zu den oben genannten biochemischen Ebenen der mRNA oder der Proteine wird die Gesamtheit der vorhandenen Metabolite „Metabolom“ genannt. Ebenso wird die Analyse des Metaboloms in Analogie zu „Transcriptomics“ und „Proteomics“ „Metabolomics“ genannt. Es wurden in drei Ansätzen „infektionsrelevante“ Aspekte im Metabolom der Wirts-Pathogen Beziehung von S. aureus und humanen Lungenzellen untersucht. Zunächst wurde in S. aureus die Verteilung von niedrigmolekularen Thiolen mittels HPLC und einer Fluoreszenz-basierten Thioldetektion analysiert. Besonderes Augenmerk wurde auf das erst kürzlich identifizierte Bacillithiol und dessen Rolle während der Infektion gelegt (Artikel I). Im Anschluss wurden zwei Arbeiten durchgeführt, die Einblicke in den Wirtsmetabolismus unter dem Einfluss von S. aureus liefern sollten. Dabei wurden humane Lungenepithelzellen als Wirtssystem gewählt, da die Lunge ein von S. aureus oft besiedeltes Habitat ist. Als erstes wurde ein artifizielles Interaktionssystem gewählt um die Komplexität der möglichen Effekte zu reduzieren. Dazu wurden die Lungenzellen mit Alpha-Hämolysin, einem von S. aureus sekretiertem Virulenzfaktor, welcher in der Wirtzellmembran Poren bildet, behandelt. Dabei wurde ein ganzheitlicher Metabolom-Ansatz durchgeführt, wobei sowohl das Medium als auch das intrazelluläre Kompartiment der Wirtzellen untersucht wurde (Artikel II). Mit diesem Ansatz konnte zunächst der Metabolom-Ansatz für eukaryotische Zellkulturen etabliert und erste, durch S. aureus verursachte, Änderungen im Wirtsmetabolom beschrieben werden. Da dieser Ansatz jedoch lediglich allein die Auswirkungen von Alpha-Hämolysin beschreibt, wurden als nächstes humane Lungenzellen mit einem S. aureus Stamm infiziert und erneut in einem Metabolom-Ansatz untersucht um der in vivo Situation einer Staphylokokkeninfektion näher zu kommen (Artikel III). Des Weiteren wurden metabolische Inhibitoren und zudem markierte Ausgangsmetabolite verwendet um Stoffwechselaktivitäten nachvollziehen zu können. Die letzte Arbeit dieser Dissertation beschäftigt sich mit dem Anpassungsverhalten von B. pseudomallei und dessen Bildung verschiedener Koloniemorphotypen. Dabei wurden durch Nährstofflimitation zunächst verschiedene Morphotypen generiert und Nährstoffaufnahmeprofile erstellt. Mit diesen Morphotypen wurden in vitro und in vivo Infektionen durchgeführt und nach Isolation wurde wieder die Kolonieform bestimmt. Anschließend wurden die Nährstoffaufnahmeprofile der Isolate mit den ursprünglichen Morphotypen verglichen (Artikel IV). Insgesamt konnten innerhalb dieser Dissertation Erkenntnisse gewonnen werden die zu einem besseren und auch komplexerem Verständnis der Wirts-Pathogen Interaktion von S. aureus und B. pseudomallei und dem Wirt beitragen. Des Weiteren bilden diese Daten die Basis für fortführende Projekte und Untersuchungen um die Verknüpfung von Infektion und Metabolismus in den hier dargestellten aber auch anderen Wirts-Pathogen-Modellen aufzuklären.Interactions between bacteria and the human body are manifold and happen constantly. Most parts of the skin and gastrointestinal tract, the saliva, the oral mucosa, the conjunctiva and the vaginal mucosa are colonized with a multitude of bacterial species forming the human microbiota. Strikingly, the estimated amount of bacterial cells outnumbers the human body by 10 to 1. However, most of these bacteria colonize the human body without positive or negative effects and are regarded as commensals. Staphylococcus aureus a Gram positive bacterium is such a commensal bacterium of 25 % to 30 % of the world population. It is also an opportunistic pathogen and is able to cause infections in the lung, skin and heart and to induce sepsis. Its pathogenicity is mainly facilitated by the secretion of a broad spectrum of virulence factors which interact with the host. Some are distracting the immune system, others are targeting the host cell membrane or degrade macromolecular structures of the host in order to provide nutrients. Furthermore S. aureus is able to invade the host cell and to survive and replicate in the host cell cytosol or other compartments. The Gram negative proteobacterium Burkholderia pseudomallei is an environmental bacterium but still has the ability to enter the human body via body orifices or skin wounds. In a very efficient way it penetrates the host cell, replicates intracellular and the uses host structures to spread from cell to cell thereby causing the disease melioidosis often with fatal outcomes. Since the natural habitats of B. pseudomallei are wet soils, the change to the environment in the human body is drastic and requires a high degree of flexibility of the bacterium. Environmental stress conditions such as temperature, pH, nutrient limitation or presence of antibiotics induce a switch of colony morphology which is a special characteristic of this bacterium. Since it is assumed, that changes in colony morphology are connected to adaptive processes to the environmental changes, these morphology switches might also be important during infection. The host organism and the host cell on the other side try to kill and remove the bacterial threat by activating the immune system and cellular defence mechanisms. This includes generation of reactive oxygen and nitrogen species, production of antimicrobial peptides and cellular processes such as phagocytosis, autophagy, apoptosis and activation of the immune response. The actions and reactions on both, the pathogen side and the host side, are summarized as host-pathogen interactions. In the field of functional genomics, methods were developed to understand various levels of host-pathogen interactions. The holistic analysis of the mRNA (the transcriptome) or translated proteins (the proteome) were already very useful tools to describe important cellular processes on the host and the pathogen site. The level of metabolites with regard to host-pathogen interactions however, has been neglected so far. In this dissertation the metabolic composition in the intracellular and extracellular space of the host and the pathogen was analyzed. For this matter biochemical analytical tools were used such as 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy and chromatographic methods (GC and HPLC) coupled to mass spectrometry. The combination of these methods allows a broad coverage of physicochemical diverse metabolites. In accordance to the above mentioned biological levels like mRNA and proteins, the sum of all metabolites is referred as the metabolome. Consequently to transcriptomics and proteomics the analysis of the metabolome is referred as metabolomics. To gain insights into the infection relevant metabolome of the host-pathogen relationship between S. aureus and human lung cells several approaches were developed. First the distribution of the recently identified bacillithiol in different S. aureus strains was investigated with regard to its role during the infection. For that matter a HPLC-methodology was used with fluorescence based detection of labelled low molecular weight thiols (article I: Distribution and infection-related functions of bacillithiol in Staphylococcus aureus). After that the next aim was to reveal the effect of S. aureus on the host cell metabolism. To reduce the complexity of effects on the host cells an artificial model was chosen in a first approach. The lung cells were treated with the staphylococcal virulence factor alpha-hemolysin, a pore forming toxin and a holistic metabolomics approach was performed (article II: Staphylococcus aureus Alpha-Toxin Mediates General and Cell Type-Specific Changes in Metabolite Concentrations of Immortalized Human Airway Epithelial Cells). Using this approach, a protocol for cell culture metabolomics was established and first changes in the host cell metabolome that could be caused by S. aureus were described. However, this only describes specific changes caused by one single virulence factor and does not necessarily describes the reality during a S. aureus infection. Therefore in a next approach, an infection model using a human lung epithelial cell line and the S. aureus strain USA300 was established and used for metabolome analysis. Furthermore a combination of inhibitor treatment and metabolic labelling was used to clarify the metabolic activity in the host cell after exposure to S. aureus (article III: Metabolic features of a human airway epithelial cell line infected with Staphylococcus aureus revealed by a metabolomics approach). Finally this thesis deals with the host-pathogen interaction of B. pseudomallei and its host with a focus on the role of the switch in colony morphology in basic metabolism. Various morphotypes of two strains were generated by nutrient limitation and their uptake of nutrients was monitored. Furthermore the morphotypes were used in in vitro and in vivo infections and subsequently isolated out of the cell line and mice respectively. After isolation, the colony morphology was determined and again the nutrient uptake profile was monitored (article IV: Burkholderia pseudomallei morphotypes show a synchronized metabolic pattern after acute infection). The information provided by this thesis adds a new complexity to the knowledge about the host-pathogen interactions of S. aureus and B. pseudomallei and their hosts. It furthermore lays the groundwork for future studies, which will deal with these and other bacterial host-pathogen interactions in order to understand the interdependencies of infection and metabolism