The Influence of Streptococcus pneumoniae Serine Proteases on Pneumococcal Pathogenesis

Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is an opportunistic human pathogen that causes life-threatening diseases including pneumonia, sepsis, meningitis but also non-invasive local infections such as otitis media. Pneumococci have evolved versatile strategies to colonize the upper respiratory tract (URT) of humans. Binding to epithelial surfaces is thereby mediated through direct interactions with host cell receptors or indirectly via binding to components of the extracellular matrix (ECM). However, successful colonization and subsequent infection require S. pneumoniae to cross tissue barriers protected by the immune system of the host. Pneumococci have therefore evolved a wide range of mechanisms to circumvent the antibacterial activity of the immune system such as the acquisition or expression of serine protease activity. Serine protease enzymes have emerged during evolution as one of the most abundant and functionally diverse groups of proteins in eukaryotic and prokaryotic organisms. However, the epithelial barriers, integrins, and other cell surface receptors are often initially inaccessible for pneumococci colonizing the nasopharyngeal cavity. Therefore, pneumococci recruit host-derived extracellular serine proteases such as plasmin(ogen) for extracellular matrix and mucus degradation, which results in enhanced binding to epithelial and endothelial cells. S. pneumoniae expresses four surface-anchored or surface-associated serine proteases depending on the serotype: HtrA, SFP, PrtA, and CbpG. These enzymes belong to the category of trypsin-like or subtilisin-like family proteins, which are characterized by the presence of three-conserved amino acid residues, Ser-His-Asp. The catalytic triads are critical for the cleavage of peptide bonds. Studies focusing on the deletion of single pneumococcal serine proteases are difficult to interpret due to the compensatory effects of the other serine proteases. Initially, a comprehensive in silico analysis of the distribution and genes organization of pneumococcal serine proteases was carried out in this study. Interestingly, the genes encoding PrtA, HtrA, and CbpG were highly conserved among the 11 analyzed strains. Surprisingly, the gene encoding the subtilisin-like protein SFP was not present in some of the strains and seems to be strain-dependent. Therefore, pneumococci have at least three serine proteases as shown e.g., for serotype 19F_EF3030 strain. Computer-assisted analyses of the structure of pneumococcal serine proteases showed high similarities in the catalytic domains between HtrA and CbpG or between PrtA and SFP in 3D structural models. The focus of this study lies on the impact of single extracellular pneumococcal serine proteases on pneumococcal pathogenesis during adherence, colonization, virulence and biofilm formation. Therefore, double and triple deletion mutants were generated in the colonizing S. pneumoniae serotype 19F strain EF3030 and the more invasive serotype 4 strain TIGR4, respectively. In adherence studies with human Detroit-562 epithelial cells, we demonstrated that both TIGR4Δcps and 19F_EF3030 mutants without serine proteases or expressing only CbpG, HtrA, or PrtA have a reduced ability to adhere to Detroit-562 cells. In a mouse colonization model, the inactivation of serine proteases in strain 19F_EF3030 strongly reduced nasopharyngeal colonization in CD-1 mice. The bacterial load in the nasopharynx was thereby monitored for a period of 14 days. Mutant strains showed significantly lower bacterial numbers in the nasopharynx on days 2, 3, 7, and 14 post-inoculations. Following up on pneumococcal pathogenesis, an in vivo acute pneumonia mouse infection model and in vitro phagocytosis was used to analyze the impact of single serine proteases during infection and phagocytosis. Mice were intranasally infected with the bioluminescent TIGR4lux wild-type or isogenic triple mutants expressing only CbpG, HtrA, PrtA, or SFP. The acute lung infection was monitored in real-time by using an IVIS®-Spectrum in vivo imaging system. The TIGR4lux mutant expressing only PrtA showed a significant attenuation and was less virulent in the acute pneumonia model. Phagocytosis assays were conducted using murine J77A.1 macrophages. The number of triple serine protease mutants internalized by macrophages were significantly reduced in comparison to the isogenic wild-type. Finally, two different experimental biofilm models were used to study the influence of serine proteases on biofilm formation grown on an abiotic surface (glass) and a biological surface. Biofilm development on living epithelial cells was stronger after 48 and 72h than on the glass surface. On epithelial substratum, the serine protease mutant with only CbpG+ showed higher and denser biofilm development after 48h and 72h of incubation compared to the parental strains and other serine protease mutants. Moreover, the bacterial dispersal from biofilms was significantly more in the mutant strains lacking serine proteases than in the wild type. In conclusion, nasopharyngeal colonization is a prerequisite for invasive diseases and transmission. Pneumococcal serine proteases are indispensable for nasopharyngeal colonization and facilitate access to eukaryotic cell-surface receptors by the cleavage of ECM proteins. Thus, serine proteases could be promising candidates for developing antimicrobials to reduce pneumococcal colonization and transmission.Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) ist ein opportunistischer, humanpathogener Mikroorganismus, der lebensgefährliche Krankheiten wie z.B. Lungenentzündungen, Sepsis, Meningitis oder nichtinvasive Infektionen, wie Otitis media, verursacht. Pneumokokken haben mehrere Strategien entwickelt, um das Epithelium der oberen Atemwege von Menschen zu besiedeln. Die Besiedlung des Epithels wird direkt durch Interaktionen mit den Rezeptoren der Wirtzelle oder indirekt durch die Bindung an die extrazelluläre Matrix (ECM) vermittelt. Allerdings muss S. pneumoniae während einer Infektion Gewebebarrieren überwinden, die u.a. vom Immunsystem beschützt werden. Deswegen haben Pneumokokken eine Vielzahl von Mechanismen entwickelt, um die antibakterielle Funktion des Immunsystems zu umgeh n wie, z.B. die Serinprotease-Aktivitäten einiger Proteine. Serinproteasen. Sie gehören zu der am meisten verbreiteten und funktionell diversen Gruppe von Proteinen in eukaryotischen und prokaryotischen Organismen. Jedoch sind die Epithelbarrieren, Integrine und andere Zelloberflächenrezeptoren zunächst unzugänglich für Pneumokokken im Nasenrachenraum. Daher benutzen Pneumokokken auch extrazelluläre Serinproteasen des Wirtes, wie z.B. Plasmin(ogen), um ECM und Mucus zu degradieren, was zu einer verstärkten Bindung der Pneumokokken an Epithel- und Endothelzellen führt. Serotyp-abhängig exprimiert S. pneumoniae bis zu vier Serinproteasen: HtrA, SFP, PrtA und CbpG, die sich alle auf der bakteriellen Oberfläche befinden. Die Enzyme sind der Kategorie Trypsin-ähnlicher oder Subtilisin-ähnlicher Proteasen zugeordnet. Sie sind durch die Anwesenheit von drei konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum, nämlich Ser-His-Asp, charakterisiert. Diese katalytische Triade ist entscheidend für die Spaltung von Peptidbindungen. Studien, die sich mit der Inaktivierung von einzelnen Serinproteasen der Pneumokokken beschäftigen, sind wegen der potenziellen, kompensatorischen Effekte durch die anderen Serinproteasen schwierig zu interpretieren. Zunächst wurde eine umfassende in silico Analyse der Verteilung und Konservierung von Serinproteasen der Pneumokokken in dieser Arbeit durchgeführt. Interessanterweise waren die Gene, die für PrtA, HtrA und CbpG kodieren, in den 11 analysierten Stämmen hoch konserviert. Überraschenderweise war das Subtilisin-ähnliche Protein SFP in einigen den untersuchten Stämmen nicht im Genom vorhanden. Daher besitzen Pneumokokken mindestens drei der vier möglichen Serinproteasen, so wie es für den Stamm 19F_EF3030 in dieser Arbeit gezeigt wurde. Computer gestützte Analysen zur Struktur dieser Proteasen zeigten bei den 3D Strukturmodellen eine hohe Ähnlichkeit in den katalytischen Domänen zwischen HtrA und CbpG bzw. zwischen PrtA und SFP. Der Fokus dieser Arbeit war die Funktion von einzelnen extrazellulären Serinproteasen von Pneumokokken in Bezug auf die Pathogenese zu untersuchen; insbesondere den Einfluss auf die Adhärenz, Besiedelung, Virulenz, und Entstehung von Biofilmen. Deswegen wurden Doppel- und Dreifach-Deletionsmutanten im S. pneumoniae Serotyp 19F Stamm EF3030 und im invasiven Serotyp 4 Stamm TIGR4 generiert. In Adhärenzstudien, in denen humane Detroit-562 Epithelzellen eingesetzt wurden, konnte gezeigt werden, dass sowohl TIGR4Δcps als auch 19F Mutanten, die keine oder nur eine Serinproteasen (CbpG, HtrA oder PrtA) exprimierten, eine verminderte Fähigkeit haben, an Detroit-562 Zellen zu binden. In einem experimentellen Kolonisierungs-Mausmodell wurde gezeigt, dass die Inaktivierung von Serinproteasen im Stamm 19F_EF3030 die nasopharyngeale Kolonisierung bei CD-1-Mäusen beeinflusst. Die Bakterienlast im Nasenrachenraum wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen beobachtet. Die untersuchten Mutanten zeigten hierbei eine signifikant geringere Bakterienzahl im Nasenrachenraum an den Tagen 2, 3, 7 und 14 nach der intranasalen Inokulation. Anschließend wurde der Einfluss der Serinproteasen bei invasiven Infektionen mittels eines in vivo Pneumonie-Maus-Infektions-Modells und durch in vitro Phagozytose überprüft. Dazu wurden Mäuse intranasal mit dem invasiven TIGR4 (Biolumineszenz-markiert) Wildtyp oder mit einem der 3-fach-Deletionsmutanten, die nur CbpG, HtrA, PtrA oder SFP exprimierten, infiziert. Die akute Lungeninfektion wurde in Echtzeit mithilfe eines IVIS®-Spektrum visualisiert. Die TIGR4lux-Mutante, die nur PrtA exprimiert, zeigte eine signifikante Abmilderung der Infektion im akuten Pneumonie-Modell. Die Versuche zur Phagozytose wurden mit murinen J77A.1 Makrophagen durchgeführt. Die 3-fach Serinprotease-Mutanten lagen in signifikant verminderter Anzahl im Vergleich zum Wildtyp-Stamm intrazellulär vor. Weiterhin zeigten Biofilmversuche mit dem Serotyp 19F die Bedeutung der CbpG-Protease in diesem Prozess. Zwei verschiedene Ansätze der Biolfilmtests wurden dafür verwendet. Zum einen die Biofilmbildung auf einer abiotischen Oberfläche (Glas) und zum anderen auf einer biotischen Oberfläche (lebende Epithelzellen). Der Biofilm war nach 48 und 72 Stunden auf lebenden Epithelzellen höher und dichter als auf der Glasoberfläche. Vor allem entwickelte die Serinprotease-Mutante, die nur CbpG+ exprimierte, einen erhöhten und wesentlich dichteren Biofilm als der parentale Wildtypstamm und die anderen Serinprotease-Mutanten. Bei der Mutante, bei der alle Serinproteasen deaktiviert waren, wurden in erheblichem Umfang Bakterien freigesetzt. Die Nasenrachenraum-Besiedelung ist eine Voraussetzung für invasive Krankheiten und Übertragung von Menschen zu Mensch. Diese Enzyme könnten vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung von antimikrobiellen Komponenten sein, die in der Lage sind, Pneumokokken-Besiedelung und -Übertragung zu reduzieren. Serinproteasen von Pneumokokken sind unabdingbar für eine Nasenrachenraumbesiedelung und beschleunigen dadurch den Zugriff zu eukaryotischen Zelloberflächen-Rezeptoren durch die Spaltung von denselben ECM-Proteinen