Integrität der Stammzellnische im sich entwickelnden Gehirn – Mechanismen, die das Neuralrohr formen

Neurulation is a complex morphogenetic process, requiring the integration of various molecular and cellular events in order to culminate in the development of sophisticated brain structures. Many mechanistic aspects of the regulatory cues, which pre-pattern the neural plate and further specification of the neuroepithelial stem cells, remain largely unknown. Nonetheless, understanding of the coordination between pivotal developmental processes is indispensable in successful prevention of congenital brain defects in human. My Ph.D. work significantly contributed to understanding the mechanisms underlying the etiology of congenital brain disorders. I functionally characterized the potential genetic modifiers rendering mouse models with a higher predisposition to neural tube defects. Results from this work can further be extrapolated to human disease penetrance. One of the key signaling molecules at the onset of neurulation is the morphogen SHH, which is required for ventral midline specification. Mice deficient for the LRP2, a SHH co-receptor in the ventral forebrain, suffer from insufficient SHH uptake by the neuroepithelium and develop holoprosencephaly (HPE) on C57BL/6N background. Congenic Lrp2 mutants on FVB/N background, however, show normal SHH levels in the ventral forebrain and normal forebrain separation. We have identified new candidate modifier genes, Pttg1 and Ulk4, that influence the capacity of SHH signaling pathway. Higher expression levels of Pttg1 and Ulk4 in developing brain of FVB/N mice are likely to contribute to advantageous cellular environment, which maintains the necessary SHH morphogen gradient in the ventral forebrain, independent of the receptor-mediated uptake, hence preventing HPE. The rational is that these novel, disease relevant, positive modulators of the SHH pathway make the early forebrain developmental processes less susceptible to disturbances in the SHH pathway. Positive regulation of the SHH machinery is associated with efficient ciliogenesis. For the first time, I describe PTTG1 as a novel primary cilia component. I identified PTTG1 at the basal body – the primary cilia organizing center – and in the ciliary shaft. The variable localization of PTTG1 amongst different cilia suggested that it is not a structurally required component of the primary cilium, but may shuttle into the ciliary shaft in a regulated fashion to support ciliary function and/or axoneme assembly, ultimately enhancing SHH signaling capacity. Besides the ventral forebrain defect, there is a SHH-independent, dorsal phenotype in Lrp2 mutant mice, reminiscent of neural tube closure defects (NTDs) affecting C57BL/6N and FVB/N mice. Combining mouse and Xenopus work from Kerstin Feistel’s lab, we unraveled a conserved, novel function of the receptor, beyond its highly anticipated signaling scope. Neural plate bending and closure is a dynamic process involving cytoskeletal remodeling and apical constriction. We characterized LRP2-dependent apical membrane remodeling necessary for efficient upfolding of the neural plate. We documented for the first time in neuroepithelium, functional interaction of LRP2 with PDZ-containing adaptor proteins, which serve as a bridge to link LRP2 to the intracellular scaffold of neuroepithelial cells. Endocytic activity of the receptor facilitates apical membrane remodeling during apical constriction and simultaneously contributes to the apicobasal distribution of VANGL2, indicating a close interface between cell shape control and maintenance of planar cell polarity. Furthermore, I report the function of LRP2 goes beyond the neuroepithelium, and affects cranial neural crest, thus placing LRP2 in the context of multiple stem cell niches in the developing brain. To conclude, on one hand, my work describes new aspects relevant for understanding the genetic modulation of signaling pathways and thus genetic predispositions to neural tube disorders. On other hand, we provide a detailed functional characterization of cell-autonomous mechanism in NTD etiology. LRP2 serves as a hub, orchestrating the signaling and endocytic pathways with cytoskeletal remodeling, at the periciliary compartment of the neuroepithelial stem cell. By this mechanism, LRP2 ensures homeostasis of neural stem cell niches and, simultaneously, facilitates the biomechanics of neural tube formation.Die Neurulation ist ein orchestrierter morphogenetischer Prozess, der die Integration verschiedener molekularer und zellulärer Ereignisse erfordert, um in der Entwicklung hochkomplexer Gehirnstruktur zu kulminieren. Viele mechanistische und regulatorische Aspekte der Vorstrukturierung der Neuralplatte sowie die genauen Grundlagen der weiteren Spezifikation der neuroepithelialen Stammzellen sind weitgehend unbekannt. Umso mehr sind weitere Erkenntnisse über die Koordination zentraler Entwicklungsprozesse für die erfolgreiche Prävention angeborener Hirndefekte beim Menschen unerlässlich. Meine Doktorarbeit trägt wesentlich zum Verständnis der Mechanismen bei, die der Ätiologie angeborener Hirnerkrankungen zugrunde liegen. Im ersten Teil meiner Arbeit führte ich die funktionelle Charakterisierung potenzieller genetischer Modifikatoren in Mausmodellen mit einer ausgeprägten Veranlagung für Vorderhindefekte durch. Die Ergebnisse dieser Arbeit können durchaus auf die Penetranz und die Expressivität menschlicher kongenitaler Defekte der Gehirnentwicklung extrapoliert werden. Eines der wichtigsten Signalmoleküle zu Beginn der Neurulation ist das Morphogen Sonic hedgehog (SHH), das für die ventrale Mittellinienspezifikation benötigt wird. Mäuse mit Verlust des low density lipoprotein receptor related protein 2 (LRP2), einem SHH-Co-Rezeptor im ventralen Vorderhirn, leiden unter einer unzureichenden SHH-Aufnahme und einem defekten Recycling des Morphogens durch das Neuroepithel und entwickeln eine Holoprosenzephalie (HPE) auf dem genetischen Hintergrund des C57BL/6N Mausstammes. Mäuse mit einer kongenen Lrp2-Mutationen auf einem FVB/N-Hintergrund zeigen jedoch eine normale Shh Expression im ventralen Vorderhirn sowie eine normale Trennung des Vorderhirnventrikels, das in normalen kortikalen Hemisphären resultiert. Mittels des Vergleichs von Transkriptomdaten konnten wir u.a. Pttg1 und Ulk4 als neue potenzielle genetische Modifikatoren identifizieren. Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, das PTTG1 und ULK4 die Leistungsfähigkeit des SHH-Signalwegs positiv beeinflussen. Höhere Expressionsniveaus von Pttg1 und Ulk4 bei der Entwicklung des Gehirns von FVB/N-Mäusen, tragen wahrscheinlich zu einer vorteilhaften zellulären Umgebung bei, die den notwendigen SHH Morphogen Gradienten im ventralen Vorderhirn aufrechterhält, trotz Verlust von LRP2. Durch diese Kompensation des Verlusts von LRP2 wird eine HPE verhindert. Wir postulieren, dass diese neu identifizierten, krankheitsrelevanten, positiven Modulatoren des SHH-Signalwegs die frühen Entwicklungsprozesse des Vorderhirns weniger anfällig für Störungen des SHH-Signalwegs machen. Eine positive Regulierung der SHH-Maschinerie ist mit einer effizienten Ziliogenese verbunden. Tatsächlich identifizierte ich PTTG1 als eine neuartige Komponente des primären Ziliums. Ich konnte PTTG1 Protein am Basalkörper, dem primären Zilien-Organisationszentrum, und im Ziliarschacht nachweisen. Die variable Lokalisierung von PTTG1 im Vergleich verschiedener Zilien deutet darauf hin, dass es sich nicht um eine strukturell erforderliche Komponente des primären Ziliums handelt, sondern in regulierter Weise in den Ziliarschacht pendeln kann, um die Ziliarfunktion und/oder den Axonemaufbau zu unterstützen und damit letztlich die SHH-Signalkapazität zu verbessern. Neben dem ventralen Vorderhirndefekt gibt es bei Lrp2 mutierten Mäusen einen SHH-unabhängigen, dorsalen Phänotyp, der an Neuralrohrverschlussdefekte (NTDs) erinnert, die sowohl die Mutanten auf C57BL/6N als auch auf FVB/N Hintergrund betreffen. Durch die Kombination von Maus- und Xenopus-Arbeiten aus Kerstin Feistels Labor entdeckten wir eine konservierte, neuartige Funktion des LRP2-Rezeptors. Der Neuralrohrschluss ist ein dynamischer Prozess mit Umgestaltung des Zytoskeletts und apikaler Verengung der Zelloberfläche. Wir fanden heraus, dass die LRP2-abhängige apikale Membranumgestaltung für eine effiziente Auffaltung (Konvergenz) der Neuralplatte notwendig ist. Wir dokumentierten zum ersten Mal die funktionelle Wechselwirkung von LRP2 mit PDZ-haltigen Adapterproteinen im Neuroepithel, die als Brücke dienen und LRP2 mit dem intrazellulären subapikalen Gerüst von neuroepithelialen Zellen verlinkt. Die endozytotische Aktivität des Rezeptors unterstützt dabei die apikale Membranumbildung während der Konvergenz zum Neuralrohr. Gleichzeitig trägt diese zur apikobasalen Verteilung von VANGL2 bei, was auf eine enge Schnittstelle zwischen der Zellformkontrolle und der Aufrechterhaltung der planaren Zellpolarität hindeutet. Darüber hinaus berichte ich, dass die Funktion von LRP2 über die Spezifizierung des Neuroepithel hinausgeht und die Entwicklung der kranialen Neuralleisten beeinflusst, wodurch wir LRP2 Funktion im Kontext von multiplen Stammzellnischen im sich entwickelnden Gehirn definieren können. Abschließend möchte ich sagen, dass meine Arbeit einerseits neue Aspekte beschreibt, die für das Verständnis der genetischen Modulation von Signalwegen und damit für die genetische Veranlagung von Neuralrohrschlussstörungen relevant sind. Auf der anderen Seite erarbeiteten wir eine detaillierte funktionelle Charakterisierung eines zellautonomen Mechanismus in der NTD-Ätiologie. LRP2 dient als Knotenpunkt, der die Signal- und Endozytosewege mit zytoskelettaler Umgestaltung im periziliären Kompartiment neuroepithelialer Stammzellen orchestriert. Dadurch gewährleistet LRP2 die Homöostase von neuronalen Stammzellnischen und unterstützt gleichzeitig die Biomechanik der Neuralrohrbildung