Intrazelluläre Lokalisation und synaptische Ausschüttung der Neurotrophine in hippokampalen Neuronen und die Bedeutung von BDNF bei hippokampaler synaptischer Plastizität

Die Mitglieder der Neurotrophin-Familie (NGF, BDNF, NT-3 und NT-4) sind sekretierte Neuropeptide, die eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von Nervenzellen und bei der Modulation der synaptischen Transmission spielen. Wenngleich eine aktivitätsabhängige Sekretion von BDNF bereits gezeigt werden konnte, wurden die subzelluläre Expression und die Ausschüttung der anderen Neurotrophine bislang nur unzureichend charakterisiert. Um die Expression und die Ausschüttung aller Neurotrophine unter identischen Bedingungen untersuchen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das Expressionsmuster und die synaptische Ausschüttung GFP-markierter Neurotrophine in dissoziierten hippokampalen Neuronen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie zeitaufgelöst untersucht. Zwei Phänotypen konnten unterschieden werden: der distale vesikuläre Expressionstyp mit Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln in distalen Neuriten, und der proximale Expressionstyp mit einer diffusen Neurotrophin-Verteilung in den Neuriten und Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln im Soma des Neurons und in den proximalen Dendriten. Der distale vesikuläre Phänotyp entsprach einer Verteilung des entsprechenden Neurotrophins in die sekretorischen Granula des aktivitätsabhängigen Sekretionsweges, während der proximale Phänotyp den Transport eines Neurotrophins in den konstitutiven Sekretionsweg widerspiegelte. Alle Neurotrophine erreichten in hippokampalen Neuronen prinzipiell beide Sekretionswege. Jedoch gelangten BDNF und NT-3 mit einer größeren Effizienz in den regulierten Sekretionsweg als NT-4 und NGF (BDNF: in 98% aller Zellen, NT-3: 85%, NT-4: 23% und NGF: 46%). Neurotrophine besitzen, wie es für sekretorische Peptide üblich ist, eine Vorläufersequenz, die während der Reifung des Proteins proteolytisch abgespalten wird. Die Fusion dieser Präpro-Sequenz von BDNF mit der Sequenz des maturen NT-4 bewirkte einen effizienteren Transport von NT-4 in die sekretorischen Granula des regulierten Sekretionsweges, und zeigte die große Bedeutung der Präpro-Sequenz für das zelluläre Verteilungsmuster von Neurotrophinen. In Neuronen, in denen die Neurotrophine in den regulierten Sekretionsweg transportiert wurden, konnte eine aktivitätsabhängige Sekretion der Neurotrophine an postsynaptische Strukturen glutamaterger Synapsen beobachtet werden. Die aktivitätsabhängige postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine zeigte eine Heterogenität in der Kinetik der Sekretion (exponentieller Abfall des Neurotrophin-Signals mit Zeitkonstanten von tau = 121 bis 307s). Die Präinkubtion mit dem Protonen-Ionophor Monensin, welcher die Neutralisation des intragranulären pH-Wertes und somit die Solubilisierung der dicht gepackten Proteinstrukturen in den Vesikeln erzwingt, erhöhte die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung auf den Wert des unter physiologischen Bedingungen schnellsten Neurotrophins NT-4. Dennoch blieb die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur Neurotransmitter-Ausschüttung langsam (tau = 13 ± 2 s). Diese Daten belegen eindeutig, dass die Neutralisation der sekretorischen Granula die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung kritisch determiniert und die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur konventionellen Neurotransmitter-Ausschüttung langsam erfolgt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Neurotrophin BDNF effizient in distale vesikuläre Strukturen von CA1 Pyramidenzellen organotypischer Schnittkulturen des Hippokampus sortiert wird. Die basalen elektrischen Eigenschaften von CA1 Pyramidenzellen BDNF-defizienter Mäuse sind vergleichbar zu den Eigenschaften von Wildtyp Mäusen. Sowohl das Eigenpotential der CA1 Pyramidenzellen, die Form der Aktionspotentiale als auch die evozierten Antworten der CA1 Pyramdenzellen auf eine gepaarte präsynaptische Stimulation der Schaffer-Kollateralen zeigten bei BDNF-/- -, BDNF+/- - und BDNF+/+ -Mäusen keine signifikanten Unterschiede. Die Fähigkeit der CA1 Pyramidenzellen auf eine hochfrequente Reizung mit einer Langzeitpotenzierung (LTP) der postsynaptischen Ströme zu reagieren ist jedoch bei den BDNF-defizienten Mäusen beinträchtigt. Eine verminderte Induktion von LTP war in den BDNF-defizienten Mäusen nach tetanischer Stimulation der präsynaptischen Schaffer-Kollateralen und simultaner postsynaptischer Depolarisation der CA1 Pyramidenzelle zu beobachten.The neurotrophins (BDNF, NT-3, NT-4/5 and NGF) modulate the survival, differentiation and synaptic plasticity in the central nervous system (CNS). These homodimeric proteins are secreted from innervated target tissue and neurons, or from the axon terminals of projecting neurons and mediate their biological effects via activation of specific tyrosine kinase receptors (Trks) and the p75 neurotrophin receptor, respectively. In spite of the wealth of knowledge regarding the biological downstream targets of neurotrophin action there is relatively little information about the routes of intracellular targeting and the sites and mechanisms of neurotrophin secretion. In order to enable a direct comparison of intracellular targeting and release properties, we overexpressed GFP-tagged versions of NGF, BDNF, NT-3 and NT-4 in hippocampal neurons, and explored quantitatively the vesicular targeting and the synaptic release of these NTs. Cultured rat hippocampal neurons were transfected at 8 DIV with the GFP fusion constructs, and investigated at 9-11 DIV. Two patterns of intracellular targeting could be distinguished: the distal vesicular expressers, showing vesicular targeting to distal neurites, or the proximal expressers, showing retention of fluorescent punctae largely in the soma, thus sparing distal neurites, but showing diffuse GFP signals in the dendrites. The distal vesicular expression pattern corresponds to a targeting of the respective NTs to vesicles of the regulated pathway of secretion, while the proximal expression pattern reflects targeting of NTs to the constitutive pathway of secretion. The distal and the proximal expression pattern, respectively, could be observed for all NTs. However, BDNF and NT-3 showed in a majority of neurons distal dendritic targeting of secretory granules, whereas NGF and NT-4 show more frequently the proximal expression pattern. In an attempt to explore the contribution of pre-pro sequences in directing a NT to distal dendrites, we transfected hippocampal neurons with a cDNA construct in which we fused the pre-pro domain of BDNF to the mature portion of NT-4. Interestingly, the pre-pro domain of BDNF targeted NT-4 more efficiently to the regulated pathway than observed for wt NT-4. These data demonstrate the essential role of the pre-pro domains for the intracellular targeting of a given NT. All neurotrophins once directed to the regulated secretion pathway were detected near synapsin I positive presynaptic terminals and colocalized with PSD95-DsRed, suggesting postsynaptic targeting of the neurotrophins to glutamatergic synapses. Depolarization induced release of all neurotrophins from synaptic secretory granules was slow (delay in onset: 10-30 s, tau = 120-307 s) compared to transmitter release kinetics monitored with FM 4-64 destaining (onset: