The role of the actin binding protein Calponin2 during embryonic development of Xenopus laevis

Despite the abundant variability among adult vertebrate body plans, the developmental steps transforming the single zygote into a multicellular organism of remarkable complexity, are evolutionary highly conserved. Morphogenetic processes such as gastrulation, neural tube closure, body axis extension, neural crest cell migration and organogenesis are thereby at the heart of embryogenesis. Especially the formation of a closed neural tube, which gives rise to the central nervous system, constitutes a fundamental event. Neural tube closure is achieved by convergent extension movements and by apical constriction of neuroepithelial cells. Along with proceeding neurulation, cranial neural cells start to delaminate from the neuroepithelial border. In order to initiate directed migration movements, neural crest cells require polarised cell protrusions and mediate mechanical forces. Changes in cell shape and motility underlying neural tube closure and neural crest cell migration are controlled by specific regulation of the actin cytoskeleton. How these actin dynamics and the myosin-mediated contraction of actin networks are precisely coordinated is not fully understood. In this context, actin filament-associated proteins play an important role for the structural organisation of different actin network types. Calponins constitute an evolutionary highly conserved family of F-actin binding proteins, which are able to influence actin-myosin dynamics and to stabilise actin filaments. Previous studies already demonstrated a role of Calponin proteins in smooth muscle contraction, cell motility and phagocytosis. Vertebrates possess three Calponin isoforms, each displaying specific expression patterns and functions. Calponin2 is expressed in a variety of cell types and several studies performed in vitro indicated that Calponin2 is important for mechanical tension mediation during the course of cell migration. In the early embryo of Xenopus laevis, calponin2 is expressed in tissues that undergo extensive morphogenetic movements and cell migration. This implies an elemental role of Calponin2 for respective morphogenetic steps during embryonic development of this well-established model organism. Within the scope of the present work, the specific function of Calponin2 for dynamic regulation of the actin cytoskeleton was analysed more closely. Localisation of the protein, by utilising a tagged construct, was shown in neural plate cells as well as in migrating neural crest cells. In both cell types, regulated protein degradation occurred, which led to specific expression restricted to the apex of constricting neural plate cells or to forming lamellipodia. Thus, tagged Calponin2 localised to regions of the actin cortex. Loss of Calponin2 function led to defects in neural crest cell specification and migration as well as in convergent extension and apical constriction within the neural plate. All induced phenotypes were rescued by additional calponin2 mRNA injection. In summary, these data demonstrated a specific function of Calponin2 for correct formation of the neural crest as well as for neural tube closure. Furthermore, the precise regulation of protein expression levels, which directly correlated with correct Calponin2 function, was dependent on specific domains that potentially mediate actin-binding. Clik1, Clik2 and the C-terminus were identified as a critical unit regulating protein degradation, both in neural crest cells and neural plate cells. Additionally, it was shown that Calponin2 function for neural apical constriction depends on each of these domains as well. Overall, the degradation of Calponin2, regulated via its F-actin binding, implies a filament stabilising function. Thus, a temporospatial coordination of protein degradation would be necessary to enable dynamic changes of the actin cytoskeleton by a regulated release of actin filaments and to allow the association of other structural effectors during morphogenetic processes of early vertebrate development.Trotz der großen Variabilität innerhalb der verschiedenen Körperbaupläne adulter Wirbeltiere sind die embryonalen Entwicklungsschritte, welche die einzelne Eizelle in einen multizellulären Organismus von bemerkenswerter Komplexität verwandeln, evolutionär hoch konserviert. Morphogenetische Prozesse wie Gastrulation, Neuralrohschluss, Körperachsenverlängerung, Neuralleistenzellmigration und Organogenese sind dabei essentiell, um komplexe Formen während der Embryogenese entstehen zu lassen. Ein bedeutender Schritt hierbei ist die Generierung eines geschlossenen Neuralrohrs, aus dem das zentrale Nervensystem entsteht. Der Neuralrohrschluss wird unter anderem durch konvergente Extension und apikale Konstriktion neuroepithelialer Zellen ermöglicht. Einhergehend mit dem Fortschreiten der Neuralulationsbewegungen lösen sich auch die kranialen Neuralleistenzellen aus dem Randbereich des Neuroepithels. Um ihre gerichtete Wanderung in den Kiemenbögen zu initiieren, müssen sie polarisierte Zellfortsätze bilden und die für Migrationsbewegungen essentiellen mechanischen Kräfte übertragen können. Die Veränderung von Zellform und Beweglichkeit, welche Neuralrohrschluss und Neuralleistenzellmigration zugrunde liegen, werden u.a. durch die gezielte Regulation des Aktin-Zytoskeletts gesteuert. Wie genau die Aktinfilament-Dynamik und die, durch Myosin vermittelte Kontraktion des Aktin-Netzwerks koordiniert wird, ist nicht vollständig geklärt. Aktinfilament-assoziierte Proteine spielen dabei eine wichtige Rolle für die strukturelle Organisation verschieden gestalteter Aktin-Netzwerke. Die Calponin-Familie ist eine Gruppe hochkonservierter Proteine, die mit Aktinfilamenten assoziieren. Die Bindung von Calponinen an F-Aktin beeinflusst die die Aktin-Myosin-Dynamik und stabilisiert Aktin-Fasern. Vorhergehende Studien haben bereits eine Funktion von Calponin-Proteinen bei der Kontraktion glatter Muskelzellen sowie für die Zellmotilität und Phagozytose aufgezeigt. Wirbeltiere besitzen drei Calponin-Isoformen mit individuellen Expressionsmustern und spezifischen Eigenschaften. Calponin2 ist in unterschiedlichsten Zelltypen exprimiert und zahlreiche In-vitro-Studien deuten darauf hin, dass Calponin2 für die Vermittlung mechanischer Kräfte bei der Zellmigration wichtig ist. Während der frühen Embryogenese des Afrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis ist calponin2 in Geweben exprimiert, die extensive morphogenetische Bewegungen und Zellmigration durchlaufen. Dies deutet auf eine Rolle von Calponin2 bei entsprechenden morphogenetischen Entwicklungsschritten dieses etablierten Modelorganismus hin. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die genaue Funktion von Calponin2 bei der dynamischen Regulation des Aktin-Zytoskeletts näher untersucht werden. Unter Verwendung einer markierten Proteinversion konnte dessen Lokalisierung in Zellen der Neuralplatte sowie in wandernden Neuralleistenzellen gezeigt werden. In beiden Zelltypen trat ein regulierter Abbau des Proteins auf, welcher zu einer spezifischen Regionalisierung des Selben am Apex konstringierender Zellen oder am äußeren Saum von Lamellipodien führte. Demnach war das markierte Calponin2 in der Region des Aktin Kortex zu finden. Der Calponin2-Funktionsverlust führte zu Defekten bei der Induktion und Wanderung von Neuralleistenzellen, sowie zur Fehlregulation der konvergenten Extension und apikalen Konstriktion innerhalb der Neuralplatte. Sämtliche dabei erzeugte Phänotypen konnten durch zusätzlich injizierte calponin2 mRNA gerettet werden. Insgesamt zeigten diese Daten eine spezifische Funktion von Calponin2 für die korrekte Ausbildung der Neuralleiste sowie den erfolgreichen Neuralrohrschluss. Des Weiteren war die genaue Regulation der Proteinlevel, welche in direktem Zusammenhang mit dessen korrekter Funktionsweise stand, von bestimmten Domänen abhängig. Diese könnten für die gezielte die Binding an Aktin verantwortlich sein. Clik1, Clik2 und der C-terminus wurden hierbei sowohl in Neuralleistenzellen als auch in Zellen der Neuralplatte als entscheidende, den Abbau regulierende, Einheit identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass die Funktion des Proteins im Rahmen der neuralen apikalen Konstriktion ebenfalls auf jeder dieser Domänen beruht. Insgesamt deutet der Abbau von Calponin2, reguliert über dessen Binding an F-Aktin, auf eine stabilisierende Funktion des Proteins hin. Demnach wäre seine räumlich und zeitlich koordinierte Degradation elementar um Aktinfilamente gezielt zugänglich zu machen für andere regulierende Effektoren und so dynamische Umstrukturierungen des Aktin-Zytoskeletts im Rahmen morphogenetischer Prozesse, während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren zu ermöglichen