The involvement of the ribosomal proteins L4 and L22 in the passage of the newly synthesized polypeptide chains through the main exit from the ribosome

The subject of this thesis was the investigation of the role of the L4 and L22 ribosomal proteins in the passage of the newly synthesized polypeptide chains through the main exit tunnel. At first, E. coli strains carrying ribosomes with different diameter entrance of the main exit tunnel, wider for N281 strain and narrower for the N282 in comparison to the diameter of the tunnel entrance of the wild type strain AB301, were examined. This widening and narrowing of the tunnel, demonstrated by cryo-electron microscopy, renders the strains resistant against erythromycin and is caused by mutations in the chromosomal L4 (Lys63Glu, strain N282) or L22 (deletions of the Met82-Lys83-Arg84, strain N281). In vivo activity studies of the above strains were carried out using SRPK1, a kinase, cloned in the pGEX-2Τ vector expressed as a fused protein with GST (Glutathione-S-Transferase). The activity of the purified kinase produced by the three strains (AB301, N281 and N282) was examined. The strains carrying the mutL22 exhibited higher biosynthetic activity than the control series and the ones carrying the L4Lys63Glu exhibited low biosynthetic activity. The in vitro results concerning the GFPem gave different results since the rate of biosynthesis was four times lower that the control in the ribosomes from the N282 strain, and two times lower in the ribosomes from the N281 strain. Mutation of the glutamic acid in the position 51 to alanine in the EcL4 and overproduction of this protein using the pET system resulted in an increase of the sensitivity against erythromycin of the E. coli strains harboring this mutL4. This is in agreement with previously published studies concerning mutTthL4Gly55Ser, although the N282 strains (L4Lys63Glu) exhibit the opposite effect (resistance against erythromycin). This particular glutamic acid (E51) is highly conserved, positioned inside the loop and probably helps in the stabilization of the loop area and through it, in the that of the hole tunnel entrance. In the second part of the thesis, total reconstitution experiments were performed and the wtL4 and wtL22 were replaced by mutated forms of these proteins whose parts of the loops had been deleted. The activity of the reconstituted ribosomes was examined using poly(phe) synthesis. Ribosomes carrying the mutL4, including the L4E51A, exhibited low activity as all the ribosomes that incorporated the mutL22 with the exception of L22-∆loop1. Ribosomes carrying L22-∆loop1 (11aa residues were deleted, 85-95, from the total 110aa of the protein) were particularly interesting since they exhibited a 50% increase in the poly(phe) synthesis. This specific protein is also incorporated in ribosomes in vivo (59%). Activity studies of the ribosomes that had been isolated from cultures after the overproduction of L22-∆loop1, followed by a washing step (500 mΜ NH₄Cl) and confirmation of the incorporation of the protein using 2D electrophoresis, showed similar peptidyl-transferase activity with the wild type ribosomes but had a 2- fold higher tRNA affinity for the A-site. In conclusion, the involvement of certain amino acids, positioned inside the loops of L4 and L22, in the geometry of the tunnel entrance and the general peptidyl transferase center and more specific in the substrate orientation is possible and requires further investigation.Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L4 και L22 στην διέλευση των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδικών αλυσίδων από κύριο κανάλι εξόδου από το ριβόσωμα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν E. coli στελέχη στα ριβοσώματα των οποίων η διάμετρος του καναλιού εξόδου των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδίων ήταν μικρότερη (Ν282) ή μεγαλύτερη (Ν281) σε σχέση με την διάμετρο των άγριου τύπου στελεχών (ΑΒ301). Η στένωση η διεύρυνση του καναλιού που αποκαλύφθηκε από μελέτες κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας στην οποία αποδίδεται και η αυξημένη αντίσταση έναντι του μακρολιδίου ερυθρομυκίνη, οφείλεται σε συγκεκριμένες μεταλλάξεις που φέρουν οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες wtL4 (Lys63Glu) και wtL22 (Met82-Lys83-Arg84) στα στελέχη Ν282 και Ν281 αντίστοιχα. Για μελέτες της in vivo λειτουργικότητας αυτών των στελεχών χρησιμοποιήθηκε η SRPK1 κινάση. Ο προσδιορισμός δράσης του καθαρού ένζυμου που προέκυψε και από τα τρία στελέχη ΑΒ301 Ν282 και Ν281 έδειξε ότι τα στελέχη Ν281 που έφεραν την L22-Δery (απαλοιφή Met82-Lys83-Arg84) εμφάνισαν αυξημένη βιοσυνθετική ικανότητα σε σχέση με εκείνα άγριου τύπου. Τα Ν282 στελέχη με την μεταλλαγμένη L4 Lys63Glu είχαν μειωμένη βιοσυνθετική ικανότητα όπως αναμενόταν. Αντίθετα αναφορικά με τις in vitro μελέτες ο ρυθμός βιοσύνθεσης της GFPem στα πρώτα 15 min βρέθηκε τέσσερις φορές μικρότερος για τα ριβοσώματα προερχόμενα από τα Ν282 στελέχη και μειωμένος κατά το ήμισυ για τα ριβοσώματα των Ν281 στελεχών σε σχέση με τον ρυθμό βιοσύνθεσης των άγριου τύπου ριβοσωμάτων από τα ΑΒ301 στελέχη E coli BL21DE3 κύτταρα μετασχηματισμένα με τον ανασυνδυασμένο φορέα pET-29c με την EcL4Glu51Ala ανέπτυξαν αυξημένη ευαισθησία έναντι της ερυθρομυκίνης σε αντίθεση με την αυξημένη αντίσταση που είχε παρατηρηθεί για τα Ν282 στελέχη. Το αποτέλεσμα αυτό παραπέμπει σε μια πιθανή εμπλοκή του συγκεκριμένου αμινοξέος και κατ’ επέκταση του βρόγχου στην σταθεροποίηση της γεωμετρίας του καναλιού εξόδου των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων. Ριβοσώματα ανασυγκροτημένα in vitro στα οποία είχαν αντικατασταθεί η η wtL4 ή η wtL22 με μεταλλάγματα των πρωτεϊνών αυτών (απάλειψη σταδιακά αυξανομένου μεγέθους τμημάτων των βρόγχων) υπεβλήθησαν σε δοκιμή poly(phe) σύνθεση. Βρέθηκε ότι τα «mutL4 - ανασυγκροτημένα» ριβοσώματα ήταν λιγότερο δραστικά σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL4. Παρόμοια χαμηλή δραστικότητα εμφάνισαν και τα ριβοσωματα που είχαν ενσωματωμένη την L4Glu51Ala. Τα ανασυγκροτημένα ριβοσωματα με τα αντίστοιχα μεταλλάγματα της L22, έκτος εκείνου της L22-Δloop1 (απαλοιφή 11 αμινοξέων 85-95 από το σύνολο των 110 αμινοξέων της πρωτεΐνης) εμφάνισαν επίσης χαμηλή δραστικότητα Αντίθετα η σύνθεση της poly(phe) σύνθεση. Βρέθηκε ότι τα «mutL4 - ανασυγκροτημένα» ριβοσώματα ήταν λιγότερο δραστικά σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL4. Παρόμοια χαμηλή δραστικότητα εμφάνισαν και τα ριβοσώματα που είχαν ενσωματωμένη την L4Glu51Ala. Τα ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με τα αντίστοιχα μεταλλάγματα της L22, έκτος εκείνου της L22-Δloop1 (απαλοιφή 11 αμινοξέων 85-95 από το σύνολο των 110 αμινοξέων της πρωτεΐνης) εμφάνισαν επίσης χαμηλή δραστικότητα. Αντίθετα η σύνθεση της poly(phe) βρέθηκε αυξημένη κατά 50% σε ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με ενσωματωμένη την L22-Δloop1 σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL22. Η αυξημένη αυτή λειτουργικότητα των L22-Δloop1- ανασυγκροτημένων ριβοσωμάτων μελετήθηκε περαιτέρω με απομόνωση ριβοσωμάτων τα οποία είχαν ενσωματώσει in vivo την L22-Δloop1 και πειράματα αντίδρασης της πουρομυκίνης. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η δράση της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης ήταν παρόμοια με εκείνη που εμφάνισαν τα άγριου τύπου ριβοσώματα η ικανότητα όμως πρόσδεσης των υποστρωμάτων στην Α-θέση ήταν διπλάσια. Η εμπλοκή επομένως κάποιων συγκεκριμένων αμινοξέων του βρόγχου των L4 και L22 τόσο στην γεωμετρία του καναλιού εξόδου όσο και στην ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, είναι πιθανή και χρειάζεται να μελετηθεί περαιτέρω