Epithelial cells from lung: production, cultivation and characterization: usage for validation of compounds efficacy in rescuing mutant CFTR

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal genetic disease among Caucasians. It is caused by mutations in the gene encoding the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) protein, a cAMP-regulated chloride (Cl-) channel that functions at the apical membrane of epithelial cells. F508del is the most common disease-causing mutation occurring in ~90% of CF patients leading to a traffic/ processing defect. Lung disease is the main cause of CF mortality. The majority of studies on wt- and F508del-CFTR proteins have been conducted in heterologous, non-epithelial or non-polarized/epithelial cellular systems. However, the efficiency of CFTR processing is cell-type and polarization dependent, being endogenous epithelial CFTR maturation significantly different from those in overexpressing systems. It is, thus important to generate models of epithelial, polarized cells so as to resemble more closely the in vivo situation. Primary cultures of human bronchial epithelial (HBE) cells are therefore instrumental for studying basic and applied aspects of CF and other lung diseases. The goals of the present work were: 1) to compare two different protocols for the isolation and cultivation of primary HBE cells regarding the isolation and dissociation of the epithelial layers; 2) to characterize the established primary HBE cultures regarding epithelial differentiation and polarization; and 3) to assess suitability of HBE monolayers to investigate efficacy of small-molecule compounds in rescuing F508del-CFTR traffic. Our data showed no significantly differences between the two protocols tested. When cultured as air-liquid interface (ALI) cultures, HBE cells are able to polarize, thus closely recapitulating their physiological morphology and epithelial characteristics. Finally, we tested these cells by Western blot for the maturation of F508del-CFTR protein following treatment with different small-molecule correctors, showing the suitability of these HBE monolayers as a valuable pharmacology model for CFTR modulator drug discovery.A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população Caucasiana com uma incidência de cerca de 1 em 2.500-6.000 nascimentos e com uma frequência de portadores de 1 em 25-40 indivíduos. Esta doença é caracterizada pela grave disfunção pulmonar causada pela acumulação de muco que tende a obstruir as vias respiratórias, resultando em infecções bacterianas recorrentes em >95 % dos pacientes. É causada por mutações no gene CFTR (do inglês "Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator") localizado no braço longo do cromossoma 7. Desde a sua identificação em 1989 até à data, mais de 1.900 mutações causadoras de doença foram já identificadas neste gene. No entanto, uma única mutação denominada F508del (representando a deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína) é responsável por 70% dos cromossomas FQ mundiais e ocorre em 90% dos doentes, pelo menos num alelo. As mutações no gene CFTR estão divididas em 6 classes definidas de acordo com as consequências que as alterações moleculares provocam, nomeadamente a alteração de função ou inibição da produção de CFTR. Esta classificação funcional é da maior importância para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas já que mutações da mesma classe vão provavelmente utilizar a mesma abordagem visando corrigir o seu defeito básico. A proteína CFTR é expressa na membrana apical das células epiteliais sendo a sua principal função o transporte de iões Cl- na membrana apical das células epiteliais das vias respiratórias, intestino, pâncreas e glândulas de suor. No entanto, a principal causa de morbilidade e mortalidade é a doença respiratória crónica, caracterizada pela colonização bacteriana das vias aéreas principalmente por Pseudomonas aeruginosa. Uma vez instaladas estas infecções bacterianas, o transporte mucociliar torna-se ineficiente e as infecções recorrentes originam uma resposta inflamatória exacerbada contribuindo para insuficiência respiratória e, em ultimo caso, à morte. O transplante pulmonar constitui assim, o último recurso para estes doentes em estados avançados. Para além dos ciclos de infecção característicos, os sintomas incluem frequentemente insuficiência pancreática (~85 % dos pacientes), ileus meconial (5-10% dos pacientes), infertilidade masculina quase universal e elevadas concentrações salinas no suor. Esta última característica era já a base do principal método de diagnóstico – o teste do suor, mesmo antes de ser conhecida a causa genética da doença. A maioria dos estudos sobre o tráfego e processamento da proteína normal (ou "wild-type", wt) e F508del-CFTR têm sido realizados em sistemas heterólogos, nomeadamente células não-epiteliais/ não-polarizadas. No entanto, tem sido demonstrado que a eficiência de processamento da CFTR está largamente dependente do tipo de célula e do grau de polarização, sendo significativamente diferente o processamento da CFTR expressa endogenamente ou em sistemas de subexpressão. Assim, torna-se importante produzir células primárias epiteliais polarizadas de forma a reproduzir tanto quanto possível as condições in vivo. Alguns laboratórios têm envidado esforços para optimizar técnicas de isolamento e cultura de células epiteliais das vias respiratórias a partir de tecido nativo. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi o de comparar dois protocolos (um proveniente da Universidade da Carolina do Norte-UNC e o outro proveniente da Vertex Pharmaceuticals) de produção e isolamento de células epiteliais primárias a partir de pulmões humanos resultantes de transplantes pulmonares, diferentes em relação ao isolamento e à dissociação do epitélio pulmonar. Pretendíamos desta forma obter um protocolo optimizado a ser utilizado no nosso laboratório. Tendo concretizado este primeiro objectivo, o segundo objetivo foi o de caracterizar as culturas de células primárias polarizadas quanto à respetiva diferenciação epitelial e polarização. Por fim, em ensaios bioquímicos e funcionais, testámos a adequabilidade destas monocamadas de células primárias, para investigar a eficácia de compostos (pequenas-moléculas) no resgate do tráfego da proteína F508del-CFTR, o que constituiu o terceiro objetivo deste trabalho. Os resultados obtidos mostraram não haver diferenças significativas entre os dois protocolos usados para estabelecer as culturas primárias. Foi importante também observar que não houve diferenças significativas entre a viabilidade celular. As principais diferenças encontradas entre os dois protocolos prendem-se com o revestimento ("coating") dos insertos de membrana porosa ("Snapwell inserts"), bem como com a formulação dos dois "Meios de Diferenciação" que foram usados. Assim, observou-se que células HBE ("Human Bronchial Epithelial") que crescem em membranas pré-revestidas com o "NIH-3T3 coating" (protocolo Vertex) não atingiram confluência, isto é, as células não foram capazes de cobrir a membrana (ao fim de 7 dias em cultura). Por outro lado, as células HBE plaqueadas em membranas com revestimento de "colagénio IV" (protocolo UNC) foram capazes de cobrir completamente a superfície da membrana após 24 h, após o qual se diferenciam num período que oscila entre as 3 e as 5 semanas, isto é, independentemente dos "Meios de Diferenciação" utilizados. Informação obtida a partir de relatórios do laboratório da Vertex, aponta para algumas diferenças na função de CFTR a partir de células que foram mantidas com "Meio de Diferenciação" com extrato de cérebro bovino (BBE, usado em "Meio Diferenciação 2"-DM2) vs extrato de pituitária bovina (BPE, usado em "Meio de Diferenciação 1"-DM1). Os mesmos autores relataram também diferenças na função de CFTR quando usam "Ultroser-G" que está no DM2, defendendo que a presença deste substituto do soro bovino fetal (mas mais concentrado) no meio está correlacionada com uma maior função de CFTR. No entanto, não pudemos comprovar estas disparidades, pois enquanto o DM2 tem na sua composição BBE e "Ultroser-G", o meio DM1 contém BPE e, em vez de "Ultroser-G", contém albumina de soro bovino (BSA) e factor de crescimento epidérmico (EGF). Assim, seria útil testar futuramente a produção de células HBE primárias com meios iguais mas apenas modificando a composição com BBE/BPE e também alternadamente com "Ultroser-G"/BSA+EGF. O segundo objectivo deste trabalho foi o de caracterizar as células epiteliais brônquicas humanas (HBE) em termos de diferenciação/polarização usando técnicas de imunofluorescência e de Western blot usando marcadores epiteliais já conhecidos. Culturas primárias de células a partir de brônquio ou de traqueia (HBE/HTE), mantidas em ALI (interface ar-liquido), conseguem imitar as condições fisiológicas in vivo e conduzem a um estado de diferenciação celular e a um fenótipo de epitélio mucociliar exibindo muitas das características das vias respiratórias humanas, incluindo a secreção de muco, motilidade ciliar e formação de junções celulares. É pois considerado um modelo fisiologicamente mais interessante quando comparado com outros modelos in vitro. No presente trabalho demonstrámos que células HBE apresentam coloração específica nas junções intercelulares para ambos os marcadores de adesão celular (ZO-1 e E-caderina). Para além disso, as células totalmente diferenciadas mostram coloração positiva para os cílios e valores de resistência elétrica transepitelial (TEER) superiores a 600Ω.cm2 o que indica serem adequadas para ensaios bioquímicos e funcionais. No terceiro objectivo deste trabalho, pretendíamos avaliar se estas células primárias polarizadas eram adequadas para testar a eficácia de pequenas moléculas no resgate da função da CFTR. Com efeito, nos últimos anos, têm vindo a ser identificadas, em "screens" de alto rendimento ("high-throughput screens"), diversas pequenas moléculas com potencial terapêutico para corrigir o defeito básico na FQ estando já algumas aprovadas para uso clínico, como exemplo o VX-661 e o VX-809 (Lumacaftor), ambos em ensaio clínicos de fase IIb, considerados "correctores". Estes compostos têm como objectivo corrigir os defeitos básicos de folding e tráfego da proteína F508del-CFTR. Por outro lado, compostos denominados "potenciadores" pretendem restabelecer o defeito de abertura ("gating") do canal de cloreto. Entre estes conta-se o VX-770 (Ivacaftor) recentemente aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), nos Estados Unidos da América e pela European Medicines Agency (EMEA) na Europa. Neste trabalho, utilizando estas células primárias HBE, testámos por Western blot o efeito de pequenas moléculas correctoras e potenciadoras da maturação e função da proteína CFTR mutada. Em geral, os resultados combinados dos ensaios bioquímicos e funcionais (dados não mostrados) revelaram que os ensaios com o VX-809/Lumacaftor apresentaram consistentemente melhores resultados no resgate da F508del-CFTR do que os reagentes de laboratório VRT-325 (C3) ou composto 4a (C4a). Os ensaios realizados com os melhores compostos ("lead compounds") obtidos através de screens realizados pelo consórcio TargetScreen2 (União Europeia) não evidenciaram efeitos claros de resgate nestas células primárias de epitélio brônquico. No entanto, estes resultados carecem de ser repetidos em diferentes células primárias originárias de doentes com FQ. Por último, a capacidade de armazenamento de stocks congelados destas células permite, não só uma maior disponibilidade deste tipo de células, bem como a produção de diferentes estágios de maturação usando amostras do mesmo paciente, mas também replicados com amostras de diferentes indivíduos. No geral, o trabalho realizado e apoiado por outros relatórios sobre o VX-770/Ivacaftor e VX-809/Lumacaftor, juntamente com dados clínicos, vêm dar suporte à utilização do sistema HBE como um modelo farmacológico útil na validação pré-clínica dos moduladores do canal CFTR