Unravelling the causes of inner ear disease

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Introdução: O ouvido interno é o órgão sensorial responsável pela manutenção do equilíbrio e pela capacidade auditiva. A surdez é a deficiência neuro-sensorial mais comum no Ser Humano, podendo ter uma origem genética e/ou ambiental. A presbiacusia, ou surdez associada à idade, é um tipo de surdez neuro-sensorial progressivo e bilateral, que resulta do efeito cumulativo de fatores intrínsecos e extrínsecos, levando à degeneração da cóclea e das vias centrais auditivas. Estudos prévios indicam uma predisposição genética para o desenvolvimento de presbiacusia. A surdez neuro-sensorial pode ocorrer associada a outros sintomas e ser intermitente em algumas manifestações como na doença de Meniere. A doença de Meniere é uma doença multifatorial, caraterizada por ataques de vertigens espontâneos, associado a surdez neuro-sensorial unilateral intermitente, acufenos e uma sensação de preenchimento do ouvido (“aura”). Os pacientes com doença de Meniere podem também desenvolver surdez neuro-sensorial bilateral, enxaquecas e doenças autoimunes sistémicas. Apesar da doença de Meniere ser considerada multifatorial, existem três hipóteses mais aceites para a sua etiologia - genética, autoimune ou alérgica – existindo evidências científicas para todas elas. A prevalência de alergias diagnosticadas em pacientes de doença de Meniere é três vezes superior à população geral. Nas doenças do ouvido há também a considerar as doenças vestibulares, que levam à perda transiente ou permanente da função vestibular. A Enxaqueca Vestibular é caraterizada pela ocorrência de episódios de sintomas vestibulares e uma história de enxaqueca, com uma associação temporal em pelo menos 50% dos ataques. A Enxaqueca Vestibular é mais comum em pacientes com doença de Meniere do que na população geral, podendo por vezes serem indistinguíveis baseado apenas em historial médico e sintomas, podendo também apresentar-se como uma comorbidade. Porém, a relação patofisiológica entre Enxaqueca Vestibular e doença de Meniere é desconhecida. Objetivos: Caracterização genética de pacientes de presbiacusia a nível dos genes GRM7 e NAT2 e haplogrupos de mtDNA; comparação da resposta imune induzida por fungos entre pacientes de doença de Meniere e Enxaqueca Vestibular. Materiais e Métodos: Estudo e análise das caraterísticas demográficas e clinicas dos indivíduos da amostra de presbiacusia (n=483, oriunda da população portuguesa), doença de Meniere (n=115, oriundas da população espanhola) e Enxaqueca Vestibular (n=73, oriundas da população espanhola); sequenciação da região HVS1 do DNA mitocondrial e determinação de haplogrupos utilizando o mtDNA Haplogroup Analysis software; genotipagem por real-time PCR dos genes GRM7 (rs11928865) e NAT2 (rs1799930, rs1799931, rs1801280, rs1208, rs1041983, rs1799929 e rs1801279). Determinação do fenótipo de acetilação do gene NAT2 utilizando NAT2PRED software. Determinação do nível de expressão de citocinas (IL-1β, IL-1RN, IL-6 e TNFα) em amostras de indivíduos com Enxaqueca Vestibular por PCR quantitativo e quantificação do nível de liberação extracelular das mesmas utilizando um Multiplex Bead-Based Kit; determinação da expressão génica por microarray de Enxaqueca Vestibular e Doença de Meniere; determinação das vias canónicas, identificação de reguladores e predição do estado (ativo/inibido) utilizando IPA® software. Resultados e Discussão: Os nossos resultados demonstram que na amostra de pacientes com presbiacusia há diferenças significativas entre a idade e o nível de perda auditiva, os homens têm uma melhor audição nas baixas frequências e as mulheres nas altas frequências evidenciando um efeito de inversão. Distintas comorbidades foram associadas a presbiacusia, nomeadamente: níveis de colesterol elevado, hipertensão, doença cardiovascular e hábitos tabágicos. O genótipo T/T do SNP rs11928865 do gene GRM7 confere uma maior perda auditiva a 8000 Hz. O haplótipo NAT2*4/NAT2*6A está associado a uma maior perda auditiva a 250 Hz. O fenótipo de acetilação lenta, no gene NAT2, tem uma maior perda auditiva, porém não existem diferenças significativas entre este fenótipo e os restantes. A origem dos haplogrupos mais detetados na nossa amostra é europeia, sendo o haplogrupo mais comum o haplogrupo H, porém também foram identificados haplogrupos asiáticos e um haplogrupo africano. Apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas, o haplogrupo com maior perda auditiva é o haplogrupo X. Os resultados de qPCR revelam que os pacientes com Enxaqueca Vestibular comparativamente a controlos saudáveis, quando estimulados com Aspergillus têm uma maior expressão de IL-1, TNFα e IL-6, porém apenas a diferença em IL-6 é estatisticamente significativa. No entanto, não se vê uma diferença na expressão de citocinas após estimulação com Penicillium. Os níveis basais de IL-1RA são mais elevados em Enxaqueca Vestibular do que nos controlos. Os níveis de IL-6 e TNFα são mais elevados em Enxaqueca Vestibular do que em controlos após estimulação com Aspergillus e Penicillium. Não existem diferenças significativas entre os níveis basais de Enxaqueca Vestibular e doença de Meniere com baixos níveis de IL-1β, porém existem diferenças significativas entre os níveis de IL-1RA de Enxaqueca Vestibular e doença de Meniere com baixos níveis de TNFα e entre os níveis de IL-1β, IL-1RA, IL-6 e TNFα de EV e doença de Meniere com elevados níveis de IL-1β e TNFα. Após estimulação, verifica-se uma diferença nos níveis de IL-1RA e IL-6 entre Enxaqueca Vestibular e doença de Meniere com baixos níveis de IL-1β e TNFα e uma diferença entre os níveis de IL-1RA entre Enxaqueca Vestibular e doença de Meniere com elevados níveis de IL-1β e TNFα. Não existem diferenças significativas entre os perfis de expressão génica entre pacientes de Enxaqueca Vestibular e controlos saudáveis e entre pacientes de Enxaqueca Vestibular e pacientes de doença de Meniere com baixos níveis de citocinas. Porém, existem diferenças entre pacientes com Enxaqueca Vestibular e pacientes com Doença de Meniere com elevados níveis de citocinas, que revelam o envolvimento da maturação de linfócitos B, produção de citocinas e a maturação de células dendríticas. A comparação da resposta a Aspergillus e Penicillium entre pacientes com Enxaqueca Vestibular e controlos saudáveis revelou diferenças no envolvimento da produção de citocinas, inflamação e da sinalização para a morte celular programada. A comparação da resposta a estimulação com Aspergillus e Penicillium entre pacientes com Enxaqueca Vestibular e Doença de Meniere revelou o envolvimento de reguladores que atuam na diferenciação, ativação e regulação de linfócitos T, no desenvolvimento de linfócitos B, na maturação de células dendríticas e na alergia. Conclusão: As doenças do ouvido interno podem ter várias causas e comorbidades associadas. Na nossa amostra de presbiacusia, os haplogrupos de mtDNA não mostram qualquer efeito na perda auditiva. Não se pode excluir o efeito genético de GRM7, NAT2 e haplogrupos do mtDNA na presbiacusia, no entanto na nossa amostra os fatores ambientais poderão ter um maior efeito para o desenvolvimento de presbiacusia do que os fatores genéticos analisados, ainda que seja de considerar o possível efeito de outros fatores genéticos nomeadamente os associados às alterações do colesterol. Os pacientes de Enxaqueca Vestibular podem ser distinguidos de controlos saudáveis e de pacientes de Doença de Meniere a partir dos níveis basais de IL-1RA. Os resultados do microarray suportam os resultados obtidos através na quantificação dos níveis extracelulares de IL-1β, IL-1RA, IL-6 e TNFα e sugerem uma resposta alérgica nos pacientes de Enxaqueca Vestibular.Introduction: The inner ear is a sensory organ responsible for the maintenance of balance and equilibrium and hearing. Age-related hearing loss (ARHL) results from the cumulative effect of intrinsic and extrinsic factors that lead to degenerative changes related to ageing of the cochlea and central auditory pathways. Meniere’s Disease (MD) is a multifactorial disorder characterized by vertigo attacks usually associated to unilateral sensorineural hearing loss (SNHL), tinnitus and aural fullness. MD patients have higher prevalence of diagnosed allergy than the general population. Vestibular Migraine (VM) is defined by occurrence of episodic vestibular symptoms and a history of migraine, however it has high symptom overlapping with other vestibular disorders, such as MD. Objectives: Genetically characterize ARHL patients at GRM7, NAT2 and mtDNA haplogroups and compare the mold-induced immune response in VM and MD patients. Materials and Methods: Demographic and clinical characterization of ARHL, VM and MD cohorts. HVS1 region sequencing and mtDNA haplogroup determination; NAT2 and GRM7 analysis by Real time PCR; cytokine expression level determination by qPCR and extracellular cytokine quantification with Multiplex Bead-Based Kit and gene expression determining by microarray. Results: Cholesterol, hypertension, smoking and cardiovascular disease were identified as ARHL comorbidities. GRM7 genotypes have significant differences for hearing loss (HL) at 8000 Hz. NAT2*4/NAT2*6A is associated to worst listening at 250 Hz. The haplogroups identified in our sample are mostly European. Haplogroup X has highest HL (not statistically significant). Allergenic extracts induce a proinflammatory immune response involving TNF-α and IL-6. Stimulation leads to the involvement of upstream regulators that take part in differentiation, activation and regulation of T-cells, B-cell development, dendritic cell maturation and allergy. Conclusion: Other variables may prevail over the genetic factor in the Portuguese population of ARHL. Basal levels of IL1-RA may allow the distinction of VM and MD. The microarray data is supportive of the findings in the extracellular cytokine measurements and suggests an allergic response in VM