Coupling of atherosclerosis progression and bone disturbances in a mouse model

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015As doenças que afectam o sistema cardiovascular e o osso estão entre as doenças que causam maior morbilidade e mortalidade na população, em especial a aterosclerose e a osteoporose. Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado que estas duas doenças podem estar relacionadas de alguma forma, uma vez que ambas as patologias estão normalmente presentes no mesmo doente. Doentes com patologia cardiovascular apresentam um risco 1.2 a 6.7 vezes maior de sofrer de fraturas de fragilidade comparando com a população em geral, e esta associação também foi demonstrada em doentes com uma massa óssea reduzida que têm um risco aumentado de desenvolver doenças ao nível cardiovascular, em especial doentes com doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistémico ou a artrite reumatoide. A aterosclerose é caracterizada pela acumulação de partículas lipídicas e células do sistema imunitário que levam ao estreitamento do lúmen das artérias, e numa fase mais avançada do processo pode ocorrer ruptura destas placas ateroscleróticas com possível formação de trombos. Estudos recentes têm demostrado o envolvimento do sistema imune na patogénese da aterosclerose. Este processo é iniciado pelos monócitos que posteriormente se diferenciam em macrófagos com capacidade de acumular lípidos no citoplasma formando as conhecidas foam cells, ou células espumosas, com capacidade de produzir citocinas pro-inflamatórias. Estas citocinas desempenham diversas funções no organismo, mas estão maioritariamente associadas a processos inflamatórios, processos estes que levam à progressão da aterosclerose, mas também estão associados a outras patologias como a osteoporose. A osteoporose é uma doença resultante de um desequilíbrio no turnover ósseo, caracterizada pela perda de massa óssea, com alteração da microarquitectura do osso, diminuição da densidade mineral óssea e consequente aumento das fraturas de fragilidade. A associação entre estas duas patologias tem ganho robustez especialmente com o paradoxo da calcificação das placas com a baixa densidade óssea e também com a presença, no vaso, de várias proteínas associadas à remodelação óssea, como RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand), OPG (Osteoprotegerin) e colagénio tipo 1. Estudos em modelos animais têm reforçado estes dados. Ratinhos knock-out para OPG, para além de apresentarem uma osteoporose generalizada, exibiram também um aumento da calcificação ao nível vascular. Este estudo centrou-se na hipótese da existência de mecanismos fisiopatológicos comuns aos dois sistemas. Pretendemos avaliar ao longo do tempo, utilizando um modelo animal (ApoE -/-) que é geneticamente propenso ao desenvolvimento de aterosclerose (por delecção do gene da apolipoproteína E), o efeito da inflamação sobre os ossos e os vasos. Os objectivos deste trabalho foram a avaliação dos níveis séricos de CTX-I (C-terminal cross-link telopeptide of type I collagen) e P1NP (N-propeptide of type I collagen), duas proteínas resultantes do processo de turnover ósseo (marcadores de reabsorção e de formação óssea, respectivamente), como também a microarquitectura óssea das vértebras lombares por histomorfometria, para compreender possíveis efeitos ao nível do osso trabecular. Pretendemos ainda avaliar a progressão das lesões ateroscleróticas e avaliar a relação entre a aorta e o osso pela determinação dos níveis de expressão de genes associados com a inflamação (interleucina (IL-) 1β; IL-6; IL-17A e TNF (Tumor Necrosis Factor)) e com a remodelação óssea (RANKL e OPG). Adicionalmente, como objectivo secundário deste estudo, pretendeu-se avaliar as variações no osso e no vaso, especialmente o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas ao nível da aorta, num modelo animal inflamatório (K/BxAg7), que desenvolve uma artrite espontânea (com consequente desenvolvimento de uma osteoporose secundária) e que foi descrito como estando predisposto para o desenvolvimento de aterosclerose. Para cumprir com os objectivos foram formados 5 grupos correspondendo aos diferentes time-points (8, 16, 20, 24 e 28 semanas de idade) para as duas estirpes de ratinhos usados (ApoE -/-, como modelo de aterosclerose, e C57BL/6, como controlo saudável), com 10 animais em cada grupo, dos quais 5 foram destinados para os testes de expressão génica (osso e aorta) e histomorfometria, e os outros 5 para avaliação das lesões na aorta. Todos os ratinhos estiveram sob uma dieta gorda desde as 10 semanas. Para o objectivo secundário foram usados ratinhos K/BxAg7 divididos em dois grupos, num foi introduzida a dieta gorda às 10 semanas de idade (N=4) e noutro manteve-se com a dieta normal durante toda a experiência (N=5). Estes animais foram avaliados às 24 semanas de idade, com doseamento dos níveis séricos de CTX-I e P1NP, avaliação da expressão génica (osso e aorta) e da presença de lesões na aorta. A todos os animais, no momento da eutanásia foi recolhido sangue por punção cardíaca e posteriormente centrifugado para a obtenção do plasma. Após perfusão, as aortas foram recolhidas e conservadas em PBS (até serem congeladas com azoto líquido para posteriormente se proceder à extração de RNA) ou em paraformaldeído para a quantificação das lesões por marcação dos lípidos com Oil Red O. Foram ainda recolhidos e imediatamente congelados diversos ossos, incluindo um fémur (após remoção da medula) para extracção de RNA e as vértebras lombares para a histomorfometria. Os níveis séricos de CTX-I e P1NP foram determinados por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e as vértebras lombares (L3-L4) foram analisadas por histomorfometria para a determinação do volume de osso trabecular, espessura trabecular e também a separação entre trabéculas. Os fémures e aortas destinados à extração de RNA foram reduzidos a um pó fino, a extração foi efectuada com TRIzol®/clorofórmio e posteriormente foi realizada a síntese de cDNA para a análise da expressão génica utilizando SYBR®Green e primers desenhados especificamente para cada gene a avaliar. A quantificação foi feita por PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativo em tempo real e na análise final todos os genes foram normalizados para o rRNA 18S utilizado como housekeeping gene (gene de referência). Todos os animais utilizados neste estudo foram avaliados semanalmente e o seu peso registado. Adicionalmente, ao modelo de artrite, e como forma de avaliar a progressão da doença, foi aplicado um score clínico avaliado pela observação semanal dos animais. Pela avaliação dos dados histomorfométricos e dos níveis séricos dos marcadores de remodelação óssea verifica-se uma concordância entre os resultados obtidos, com uma diminuição significativa no volume ósseo, na espessura trabecular e níveis de P1NP ao longo do tempo, e um aumento na separação inter-trabecular e nos níveis séricos de CTX –I, sugerindo que ambos os grupos experimentais foram sofrendo de uma perda de massa óssea, com especial ênfase no grupo ApoE -/-, onde se verificaram algumas diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo B6. Os resultados obtidos na expressão génica mostraram algumas diferenças estatisticamente significativas entre B6 e ApoE -/-, contudo, de uma maneira geral, foi o grupo dos ratinhos B6 que apresentou maiores níveis de expressão das citocinas, tanto na aorta como no osso. Não se encontrou uma associação com significância estatística na correlação da expressão das citocinas entre os dois tecidos. No entanto verificámos a existência de uma relação entre IL-1β e IL-6, e entre TNF e OPG no osso dos ApoE -/- às 16 semanas e no grupo dos B6 às 28 semanas apenas entre TNF e OPG, mas estas correlações foram pontuais, cingindo-se a apenas um ponto de avaliação, e não se verificou a continuidade destas correlações nos time-points seguintes. A falta de um forte suporte estatístico nestes resultados pode dever-se ao facto de a expressão dos genes avaliados, principalmente na aorta, apresentar valores muito dispersos, além de serem muito diferentes dos valores obtidos no osso. Esta discrepância poderá dever-se ao facto de a aorta ser um tecido menos robusto e que poderá estar mais susceptível à degradação do RNA durante o processamento da amostra. Procedeu-se posteriormente à comparação dos dados obtidos nas diversas análises efectuadas, medição de marcadores séricos, histomorfometria e expressão génica. Observou-se uma correlação negativa entre a espessura trabecular e os níveis de expressão da OPG no osso dos ratinhos ApoE -/- com 16 semanas, e também entre o volume ósseo e a separação trabecular no grupo B6 às 28 semanas, mas mais uma vez estas correlações foram pontuais, sem grande significado biológico. Estes resultados estão de acordo com o esperado face aos dados epidemiológicos e de estudos em modelo animal que reforçam a associação entre a progressão da aterosclerose e a perda de massa óssea com possível desenvolvimento de uma osteoporose. Contudo os dados de expressão génica não apoiam esta conclusão (chegando a ser discordantes), apesar de existirem alguns estudos com este modelo animal que reportam um aumento da formação óssea em ratinhos ApoE -/-, pelo que os dados com este modelo são ainda um pouco contraditórios. É importante ter em conta que o grupo controlo (B6) estava também sujeito a dieta gorda, uma vez que esta dieta potencia e acelera o desenvolvimento das lesões ateroscleróticas nos ratinhos ApoE -/-. A dieta gorda foi introduzida em ambos os grupos, a fim de uniformizar qualquer alteração introduzida pela dieta, pois um estudo prévio de Hirasawa et al. reportou que a dieta gorda induz uma redução da mineralização óssea. No entanto face aos resultados obtidos, este trabalho poderia beneficiar de uma análise dos parâmetros estudados, num grupo controlo (B6) sem dieta gorda de forma a verificar os níveis normais de todas as proteínas estudadas. Quanto ao objectivo secundário e ao modelo de inflamação (K/BxAg7), não foram encontradas lesões ateroscleróticas visíveis na aorta, contrariamente ao que foi reportado por Rose et al.. Este resultado poderá ter duas justificações: as condições de alojamento dos animais, visto que se encontravam num biotério de roedores SPF (specific pathogen-free), e o tempo de avaliação deste estudo. Relativamente às condições de alojamento, estas podem ter influência na microbiota o que, por sua vez, poderá ter um importante papel no desenvolvimento das lesões (foi já descrito como tendo uma elevada relevância no desenvolvimento de diversas doenças inflamatórias). Os dados preliminares obtidos não mostram nenhuma diferença estatisticamente significativa, contudo, de uma forma geral, ambos os grupos de K/BxAg7 mostraram níveis elevados da expressão dos genes analisados. No entanto, os níveis séricos apontam para uma remodelação óssea alterada no sentido da formação (aumento dos níveis de P1NP, e do ratio CTX-I/P1NP), contrariamente ao esperado, não só pela descrição do modelo, como pelo aumento do score clínico verificado nestas animais ao longo do tempo. Conclui-se com este trabalho que o modelo animal de aterosclerose apresenta algumas alterações ao nível do osso, ao longo do tempo, apesar dos resultados obtidos necessitarem ser confirmados para melhor compreensão do seu significado biológico. De forma a melhorar este trabalho seria interessante aumentar o número de animais em estudo (B6, ApoE -/- e K/BxAg7) para reforçar o poder estatístico dos resultados, como também para verificar se as tendências observadas se mantêm. Relativamente ao modelo animal de inflamação, em específico, seria importante fazer uma análise histomorfométrica para avaliar as alterações na microarquitectura do osso, num modelo caracterizado pelas conhecidas alterações ósseas, e uma vez que não se observaram lesões visíveis nos vasos destes ratinhos, e sabendo a importância do ambiente em que os animais estão alojados, seria importante testar os efeitos sobre os vasos deste modelo num ambiente menos limpo, colocando-os por exemplo, num biotério convencional. Será também interessante, se os ratinhos apresentarem lesões em ambos os tecidos (ossos e vasos), avaliar a progressão estudando os mesmos time-points definidos para os outros modelos experimentais.Several epidemiological studies have revealed a link between atherosclerosis and osteoporosis, suggesting the existence of common underlying mechanisms. This relationship maybe due to the inflammatory processes that underlies both diseases. Thus, mechanisms regulating inflammation and also bone remodeling could represent potential links between these two diseases. Therefore this work focused on the evaluation of the alterations in bone and vessel of an animal model of atherosclerosis (ApoE -/-). Using different time-points, we measured the serum levels of CTX-I and P1NP to evaluate the systemic repercussions of bone remodeling, and performed histomorphometric analysis to evaluate bone behavior. We have also evaluated the relative gene expression, in bones and aortas, of genes associated with inflammation (IL-1β, IL-6, IL-17A and TNF) and also RANKL and OPG, associated with bone remodeling. The histomorphometric analysis and bone turnover proteins determination in serum shown concordant results, pointing towards bone loss, with the decrease levels of bone volume, trabecular thickness, and P1NP levels in serum coupled with an increase in trabecular separation, and CTX-I in serum. The expression of the genes associated with inflammation in ApoE -/- mice has, in general, lower levels, even in the later time-points, when compared to C57BL/6 mice. Additionally, a mouse model of inflammation (K/BxAg7) was used to evaluate the progression of both diseases in the same organism, these mice did not developed visible atherosclerotic lesions in the aorta and no significant differences were found comparing to a healthy group (C57BL/6 mice), despite the K/BxAg7 displayed a general increase in the expression of the inflammation related genes, in both aorta and bone. Our finding suggests that ApoE -/- mice suffer from bone alterations, and that could be associated with the atherosclerosis development although we did not find any correlation with inflammatory genes in the tissues affected. To complement this project it will be interesting to increase de number of animals in the study and also to include another group composed by B6 mice but without the fat diet. As for the model of inflammation, it will be interesting to house this animals in a conventional animal facility, with a more challenging environment, to see if any visible atherosclerotic lesion appear