Aloe species in colorectal cancer therapy: friend or foe?

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016Aloe plants have been suggested to be an important natural source of medical therapy agents (including for cancer) for several years. Throughout the world, pharmaceutical companies and institutions are struggling to isolate its most potent bioactive compounds as a primary means of using its activities. Regardless of the species used, the extraction procedure selected or the lack of specific compounds responsible for any given bioactivity, the fact is that we have been witnessing several debates, disputes and a lot of conflicting results arising on the claimed anticancer properties of Aloe species. During the last decade, several reports demonstrated that a subgroup of matrix metalloproteinases (MMPs) called gelatinases (MMP-2 and especially MMP-9), are largely responsible for colorectal cancer progression/metastasis, suggesting that MMP inhibitors (MMPIs) may be a powerful tool to reduce cancer invasion. Although Aloe’s activities suggest they might inhibit MMPs, no studies have related their reported anticancer activity with MMPI activities. Also, although approximately 500 species have been identified so far within the Aloe genus, A. vera is the most widely studied albeit other species such as A. arborescens have also been reported to exhibit similar bioactivities. Hence, the goal of the present study was to compare the anticancer potential of two Aloe species, A. vera and A. arborescens and to ascertain if they are specific MMP-9 and/or MMP-2 inhibitors. Different types of extraction were tested (100% (v/v) methanol, 50% (v/v) methanol and 100 mM Tris-HCl buffer pH 7) and specific bioactive compounds (proteins, total phenolic compounds, anthraquinones and total carbohydrates) were quantified and compared. Although there were a few variations between species and between extractions, 50% (v/v) methanol was selected as the best extraction procedure. Anticancer activities were measured in vitro using the wound healing model assay in the human colon cancer cells HT29, and A. vera showed significantly higher inhibitory potencial regarding wound closure. Furthermore, it was also evaluated their effects on gelatinase activities, measured by gelatin zymography and the DQ gelatinase assay. When assessing the total gelatinolytic activity, both species had a similar result of around 20% inhibition. Through the gelatin zimography we demonstrated that both MMP-9 pro-form and active form were inhibited, but only the MMP-2 pro form were inhibited, which corroborates the results obtained with the total gelatinolytic activity assay. The gelatinolytic activity of MMP-9 showed that although both species have the potencial to inhibit specifically this metalloproteinase, A. arborescens have a significantly higher inhibitory effectiveness. Overall, our data provided clear indication that A. arborescens and A. vera have indeed potential as inhibitory agents in cancer therapy, being able to reduce colon cancer cell proliferation and invasion, possibly via specific MMP-9 inhibition. A. arborescens appears to be a more effective cancer cell invasion inhibitor than A. vera. Also, we observed that different types of extraction are important to obtain higher amounts of bioactive compounds and also higher levels of bioactivities. This might be due to a greater amount of extractable bioactive compounds such as anthraquinones. These results open novel perspectives on the mode of action of Aloe species in cancer invasion and may provide clues as to why there are so many conflicting results.Desde a antiguidade que as espécies do género Aloe são consideradas como uma importante fonte natural de compostos terapêuticos. Contudo, nas últimas décadas tem-se verificado um crescimento rápido e exponencial do interesse popular nestas plantas. O Aloe barbadensis (mais vulgarmente conhecido como Aloe vera) é, entre as espécies deste género, a mais reconhecida e popularizada sendo-lhe atribuídas uma miríade de aplicações e indicações terapêuticas, muitas vezes não fundamentadas cientificamente. Consequentemente, a nível mundial, tanto empresas como instituições farmacêuticas procuram avidamente separar e identificar os compostos bioativos mais potentes entre espécies de Aloe, como forma de isolar potenciais bioatividades para aplicar em fármacos ou em produtos vendáveis. Contudo, tem surgido um grande debate entre a comunidade científica sobre o verdadeiro valor terapêutico desta espécie; enquanto alguns trabalhos científicos advogam o seu grande potencial, outros desacreditam totalmente os seus efeitos, alertando mesmo os seus eventuais perigos para a saúde. Existem várias razões possíveis para justificar estas inconsistências nos estudos publicados até à data. A. vera é a espécie mais utilizada e conhecida atualmente, sendo o elemento do seu género mais amplamente estudado, apesar de outras espécies tais como A. arborescens e A. Ferox terem sido igualmente descritas como tendo bioatividades semelhantes ou mesmo superiores. Existe também grande inconsistência em relação ao tipo de solventes a utilizar nas extrações, o que pode influenciar a biodisponibilidade e quantidade de compostos ativos. Além disso, cada vez mais parece evidente que a ação terapêutica das plantas de Aloe poderá estar associada a uma sinergia entre os vários compostos bioativos presentes nas suas folhas e não apenas à ação de um único composto isolado. Por tudo isto, existe ainda muito trabalho a realizar e muitas questões que deveriam ser abordadas em relação a estas espécies. Uma das aplicações mais conhecidas e procuradas do género Aloe é o seu potencial efeito antitumoral. Vários estudos têm comprovado que existe de facto um efeito preventivo e inibidor de vários tipos de tumores induzido pelos extratos e compostos de Aloe. Contudo, o mecanismo através do qual estes efeitos são exercidos ainda não está totalmente esclarecido. Durante a última década, vários estudos revelaram que existe um subgrupo de metaloproteinases de matriz (MMPs), as gelatinases (MMP-2 e MMP-9), que estão envolvidas no processo de metastização. Estes trabalhos têm demonstrado que os seus inibidores (MMPIs) poderão ser uma ferramenta muito útil para reduzir a invasão tumoral. Estas enzimas (sobretudo a MMP-9) também estão fortemente envolvidas em processos de cicatrização e de inflamação. Deste modo, o facto de os efeitos das plantas de Aloe estarem associados simultaneamente a atividades cicatrizantes, anti-inflamatórias e antitumorais sugere que poderão influenciar o mecanismo de ação da MMP-9 e da MMP-2. Contudo, até à data, ainda não existem estudos que associem o potencial anti-tumoral das espécies de Aloe com uma possível inibição das duas gelatinases Assim, neste contexto, no presente trabalho decidiu-se determinar e comparar a atividade anti-tumoral de duas espécies do género Aloe bastante conhecidas, A. vera e A. arborescens, avaliando o seu impacto no crescimento e na migração de células de adenocarcinoma do cólon e determinando se estes efeitos estão ou não associados a alguma influência na atividade das MMP-9 e/ou da MMP-2. Foram primeiramente avaliadas as diferenças entre as duas espécies de Aloe, através da caraterização de diferentes compostos com potencial bioativo já descritas para este género, nomeadamente proteínas, compostos fenólicos, antraquinonas e hidratos de carbono totais. Foi também objetivo testar diferentes métodos de extração e tentar compreender qual o melhor processo de modo a obter o maior teor de compostos bioativos. Todos os compostos foram quantificados em três tipos de extracção: aquosa (em tampão Tris-HCl), hidro-metanólica (50% (v/v) metanol) e metanólica (100% (v/v) metanol). Os resultados mostraram que, apesar de o teor em compostos bioativos não ter variado de forma marcada entre as duas espécies, A. vera apresentou um teor mais elevado em compostos fenólicos totais, enquanto A. arborescens apresentou valores superiores em antraquinonas. Os resultados comprovaram também que o método de extração não só influencia fortemente a quantidade de compostos bioativos isolados, como também difere entre as duas espécies. Por exemplo, enquanto A. vera mostrou de um modo geral um maior teor em compostos extraídos a 50% (v/v) metanol, no A. arborescens estes valores variaram consoante os compostos determinados. Isto é de extrema importância uma vez que muitos estudos utilizam apenas um tipo de extração, independentemente da espécie e do composto a isolar, sendo raros os artigos que utilizam a extração hidro-metanólica. Em segundo lugar, foi determinado o potencial anti-tumoral dos melhores extratos de Aloe em células de adenocarcinoma do cólon humano (células HT29), utilizando os métodos padrão de proliferação celular e de invasão celular. O trabalho efetuado mostrou que as duas espécies estudadas apresentam de facto potencial para serem inibidoras do desenvolvimento tumoral, reduzindo tanto o crescimento celular como a invasão por células HT29. A inibição do crescimento das células tumorais foi dependente da dose e semelhante entre as duas espécies. Estes resultados permitiram ainda selecionar uma concentração EC50, que foi utilizada nos estudos subsequentes. Nos estudos de invasão tumoral, verificou-se que, apesar de as duas espécies terem tido atividades similares na proliferação celular, na invasão A. arborescens revelou ser a espécie com maior atividade, atingindo valores de inibição semelhantes ao conhecido inibidor de MMP-9, doxiciclina. Estes resultados sugerem que as pequenas diferenças de compostos bioativos observadas anteriormente, nomeadamente o maior teor em antraquinonas, poderão estar associados a um maior potencial de inibição por parte de A. arborescens. Uma vez que, segundo a literatura, uma maior inibição na invasão está normalmente associada a uma redução na atividade das gelatinases MMP-9 e MMP-2, foi subsequentemente avaliada a atividade destas duas enzimas no meio extracelular das células HT29, após exposição aos extratos de cada uma das espécies de Aloe. Para tal, foi utilizado o método da DQ gelatina que avalia a atividade gelatinolítica total e a zimografia de substrato, que separa as MMP-9 das MMP-2 num gel SDSPAGE, permitindo a avaliação da atividade específica de cada uma. Os resultados das atividades das gelatinases corroboraram que os extratos das duas espécies possuem de facto capacidade de inibição das gelatinases, mas com maior especificidade para a MMP-9 do que para a MMP-2. De forma a testar se esta inibição ocorre por influência direta na enzima, foi ainda efetuado um ensaio de inibição enzimática com uma MMP-9 comercial na presença da DQ gelatina. Ambas as espécies mostraram inibir a gelatinase MMP-9. Contudo, o extrato de A. arborescens mostrou maior atividade inibitória que o de A. vera. Não obstante, a inibição da MMP-9 não foi tão elevada como a verificada nas zimografias do meio extracelular das células HT29. Deste modo, os resultados sugerem que poderão existir outros mecanismos de ação que não apenas a inibição direta da enzima. Em conclusão, o trabalho efetuado mostrou que as duas espécies estudadas de Aloe apresentam de facto um potencial para serem inibidoras do desenvolvimento tumoral, inibindo tanto o crescimento celular como a invasão. Os resultados mostram também que esta inibição pode estar relacionada com uma redução específica da atividade da MMP-9 e da MMP-2. Apesar de terem concentrações semelhantes das várias classes de compostos bioativos, A. arborescens parece ser um inibidor da invasão tumoral mais eficaz do que A. vera. Isto pode ser devido a uma maior quantidade de compostos bioativos individuais, como as antraquinonas presentes em A. arborescens, ou à presença de compostos específicos ainda não identificados nessa espécie. Os resultados aqui apresentados mostram igualmente que a utilização de espécies de Aloe, quer seja na prevenção ou na terapia tumoral, deve ter sempre em consideração o tipo de extração, devendo esta adaptar-se de acordo com a espécie e o objetivo em mente; de outro modo podem não ser obtidos os resultados mais realistas e reveladores do verdadeiro potencial da espécie. De um modo geral, A arborescens parece ser uma alternativa mais eficaz do que A. vera no caso da inibição e da invasão celulares, sugerindo um elevado potencial de utilização como coadjuvante em terapias tumorais, ou ainda na prevenção da formação de metástases em tumores já estabelecidos. Uma vez que a inibição direta das enzimas parece não ser o seu único mecanismo de ação, mais estudos deveriam ser efetuados para determinar a sua toxicidade e efeitos. Não obstante, os resultados obtidos neste trabalho abrem as portas para novos trabalhos sobre a inibição de MMPs por parte das espécies de Aloe, chamando a atenção para a necessidade de uma reavaliação do tipo de metodologias de extração utilizados, bem como as espécies utilizadas e respetivos alvos terapêuticos