Desenvolvimento de método analítico indicativo de estabilidade para o controle de qualidade químico e biofarmacêutico de linagliptina

Linagliptina (LGT) é um fármaco membro da classe de gliptinas que inibe a enzima dipeptidil - peptidase - 4 . Elas são usadas para reduzir os níveis de glicose no sangue em pacientes com Diabetes mellitus tipo 2. Devido a seu recente desenvolvimento e lançamento no mercado, a LGT não tem monografia em compêndio oficial, nem em registros nacionais ou internacionais disponíveis para determinações qualitativas e quantitativas indicativas de estabilidade do fármaco. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método cromatográfico para caracterizar LGT em forma de comprimido contendo 5 mg do fármaco, avaliar a cinética de degradação de LGT frente à condição alcalina (padrão e amostra), determinar a possível citotoxicidade dos produtos de degradação, tanto do fármaco quanto do padrão, em células mononucleares e sugerir os possíveis principais produtos de degradação, além de desenvolver método de dissolução para os comprimidos. Um método simples por cromatografia líquida de fase reversa indicativo de estabilidade foi otimizado e validado de acordo com o International Conference on Harmonization sob os critérios de aceitação como especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e adequabilidade do sistema. A coluna analítica C8 (150 mm x 4,6 mm x 5 μm) foi utilizada a 30 °C com uma mistura de água (trietilamina 1,0 %, ajustado para pH 4,5 com ácido ortofosfórico) e de acetonitrila (80:20, v/v), com vazão de 1,2 mL.min-1 e a detecção a 293 nm. Os excipientes não interferiram na determinação da LGT. Além disso, em estudos de degradação forçada, não foi observada interferência no pico do fármaco. A cinética de degradação em meio básico sob aquecimento a 60 °C foi determinada e tanto padrão e amostra seguem cinética de primeira ordem com constante (k) igual a 0,25 h-1 e 0,21 h-1, t ½ igual a 2,77 h e 3,31 h e coeficiente de determinação igual a 0,9153 e 0,9775 para o padrão e amostra, respectivamente. Foram avaliados os danos da membrana celular provocados pela LGT a 100 mg mL-1 e pelos produtos de degradação formados. Nas concentrações avaliadas e na degradação forçada até 50% e 100% dos comprimidos, não foi verificado nenhum dano celular tanto à luz UV-C quanto na condição alcalina. As estruturas moleculares foram sugeridas a partir de análises de espectro de massa para a identificação dos produtos de degradação formados. A LGT foi obtida após 6,3 min de análise e a resposta foi linear na faixa de 1-50 μg mL-1 (r = 0,9998 ), observou-se regressão linear significativa e desvio da linearidade não significativa por meio de análise de variância. O método foi preciso (DPR intradia e interdia < 1,10 %), exatidão (média de recuperação = 98,6%), e robusto. Limite de detecção e limite de quantificação foram de 0,14 e 0,45 mg.mL-1, respectivamente. Para análise biofarmacêutica foi desenvolvido método de dissolução utilizando meio citrato pH 3,5 com aparato cesta, velocidade de agitação de 75 rpm à temperatura de 37 ± 0,5 °C. De acordo com os resultados obtidos, o fármaco pode ser um candidato à bioisenção. As condições propostas foram aplicadas com sucesso para a análise quantitativa da LGT em comprimido, o que ajudará a melhorar o controle de qualidade de medicamentos e contribuir para estudos de estabilidade desta gliptina.Linagliptin (LGT) is drug a member of the class of gliptins that inhibits the enzyme dipeptidyl-peptidase-4. They are used to reduce glucose blood levels in patients with type 2 Diabetes mellitus. Due to its recent development and market launching, LGT has no official compendium monograph, national or international, or available registries for qualitative and quantitative determinations of this drug. The objective of this work was to develop a LC method to characterize LGT in tablet dosage form containing 5 mg, evaluating the kinetics of degradation of LGT (standard and sample), determining the possible cell membrane damage of drug degradation products in mononuclear cells and suggest the possible major degradation products. A simple and stability-indicating reversed-phase liquid chromatography method was optimized and validated according to International Conference on Harmonization acceptance criteria for specificity, linearity, precision, accuracy, robustness and system suitability. A C8 analytical column (150 mm x 4.6 mm x 5 μm) was operated at 30 °C with a mixture of triethylamine 1.0% and acetonitrile (80:20, v/v), adjusted to pH 4.5 with ortophosphoric acid, at a flow rate of 1.2 mL min-1 and detection at 293 nm. The excipients did not interfere in the determination of LGT. Furthermore, in forced degradation studies no interference in the drug peak was observed. The kinetics of degradation in basic medium under heating at 60 °C was determined and standard both standard and sample follows first order kinetic with constant (k) equal to 0,25 h-1 and 0,21 h-1, t½ equal to 2,77 h and 3,31 h and coefficient of determination equal to 0,9153 and 0,9775 for standard and sample, respectively. The cell membrane damage of LGT at 100 μg mL-1 and the formed products by its degradation were evaluated. At the appraised concentration and at forced degradation until 50% and 100% of the tablets, both UV-C light and alkaline conditions, no cell damage was verified. Structures were suggested for identifying the degradation products formed from mass spectral analyzes. The chromatography was obtained within 6.3 min and the response was linear in the range of 1–50 μg mL-1 (r= 0.9998) showed significant linear regression and non-significant linearity deviation by analysis of variance. The method was precise (intra-day relative standard deviation (RSD) and inter-day RSD values < 1.10%), accurate (mean recovery = 98.6%), and robust. Limit of detection and limit of quantitation were 0.14 and 0.45 μg mL-1, respectively. For biopharmaceutical analysis, a dissolution method was developed using citrate medium pH 3.5, basket apparatus, stirring rate of 75 rpm at temperature of 37 ± 0.5 °C. According to the results, the drug may be a biowaiver candidate. The proposed conditions were successfully applied for the quantitative analysis of LGT in tablet dosage form, which will help improving the drug quality control and contribute to stability studies of this gliptin