Functional aspects of new helper factors for HIV replication

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Human immunodeficiency virus (HIV) depends on the host cell machinery to complete its life cycle. Several host proteins may help the virus to replicate and others have the ability to suppress its replication. These helper and restriction factors might be involved in many different pathways, such as RIG-I like helicases (RLH) signaling or microRNA (miRNA)-mediated silencing pathways, or could be a member of a specific group of proteins, like kinases and phosphatases. Here, we conducted a shRNA screen focused on innate antiviral defenses. Our study discovered 4 factors involved in HIV-1 replication: two participate in miRNA silencing, RNASEN and TNRC6A; and two proteins are regulators of RLH signaling pathway, ISG15 and OTUD5. RNASEN and ISG15 showed a helper factor nature regarding HIV-1, while TNRC6A and OTUD5 appear to have a restriction effect in HIV-1 replication. We also proceeded to the characterization of previously identified helper factors in other shRNA screen performed by Rato et al. For this purpose, we evaluated the effect of 13 proteins from the 14 identified in HIV-2 cycle, which exhibited a similar outcome from the one observed in HIV-1. From all kinases and phosphatases identified, we observed that one protein, CIB2, when overexpressed led to an enhanced LTR-driven expression, suggesting a role for CIB2 in HIV-1-LTR transcription. Moreover, we assessed that two of the identified proteins, SGK and CIB2, are important in HIV-1 entry, since their knockdown reduces the number of fusion events. In conclusion, this study highlights the power of small scale RNAi screens, providing new insights for the complex host-HIV interactions and instigating new possibilities for antiviral strategies.Introdução O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 (Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1) é do género Lentivirus da família Retroviridae. O seu genoma é formado por duas moléculas de RNA com cerca de 9 kb, flanqueadas por repetições terminais longas (long terminal repeats, LTR) e com 9 grelhas de leitura abertas (open reading frame, ORF). As 4 proteínas Gag – matrix (MA), cápside (CA), nucleocápside (NC) e p6 – e as 2 proteínas Env – glicoproteína de superfície gp120 (SU) e glicoproteína transmembranar gp41 (TM) – são componentes estruturais. As proteínas Pol – protease (PR), transcriptase reversa (RT) e integrasse (IN) – providenciam as funções enzimáticas. Adicionalmente, 6 ORF originam as proteínas acessórias Rev, Tat, Vif, Vpr, Nef, e Vpu, que regulam a expressão dos genes virais e que participam no processo de encapsidação, aumentando a eficiência da infecção. A fase precoce do ciclo de replicação viral inicia-se com a ligação de um virião infeccioso ao receptor celular de superfície CD4, através da glicoproteína de superfície do vírus, gp120 (SU). Esta sofre alterações conformacionais que permitem o reconhecimento dos co-receptores, em particular CCR5 e CXCR4 no HIV-1, possibilitando a fusão do invólucro viral com a membrana celular e consequentemente a entrada viral. No citoplasma, o RNA genómico viral em cadeia simples é convertido pela transcriptase reversa (RT) num intermediário de DNA de cadeia dupla, que é então transportado para o núcleo na forma de complexo de pré-integração (PIC), e integrado no genoma da célula, por acção da integrase. Na fase tardia do ciclo, os genes do DNA proviral são transcritos e traduzidos pela maquinaria da célula hospedeira em proteínas virais. As proteínas estruturais são transportadas para a membrana plasmática onde se acumulam. A poliproteína Gag liga-se ao RNA genómico do vírus e então interage com a membrana plasmática, que é forçada a se projectar e eventualmente a se separar, formando-se uma partícula que é libertada para o exterior da célula infectada. A maturação do virião, iniciada pela protéase, resulta na reorganização nuclear e a aquisição da infecciosidade viral. Vários autores focaram o seu estudo em vias celulares, que envolvem imunidade inata e defesas antivirais. Uma das vias inatas antivirais é a detecção de RNA viral através de receptores intracelulares que pertencem à família das helicases do tipo RIG-I (RIG-I like helicases, RLH). Após a ligação ao RNA, a RLH RIG-I ou MDA-5 sofre uma mudança conformacional que permite a interacção entre os domínios CARD da RLH e da proteína mitocondrial VISA. Desta interacção resulta a rápida indução de citocinas antivirais incluindo o interferão (interferon, IFN) tipo I, através da activação de IRF3-IRF7 ou NF-κB mediada por TRAF6 e TRAF3, respectivamente. Várias moléculas reguladoras participam nesta sinalização, incluindo ISG15 (IFN-stimulated gene 15), RNF125 (Ring finger protein 125), ATG5 (Autophagy related protein 5), ATG12 (Autophagy related protein 12), LGP2 (Laboratory of genetics and physiology 2), OTUD5 (OTU domain containing 5), e PIN1 (Peptidylprolyl cis/trans isomerase, NIMA-interacting 1). As possíveis interacções entre transcritos virais e a maquinaria da célula hospedeira para a tradução, o armazenamento e a degradação de mRNAs surgem como um aspecto significante da resposta antiviral. Este processo de turnover do RNA mediado por microRNAs (miRNAs) pode ocorrer em focos citoplasmáticos chamados P-bodies (mRNA processing bodies). Vários estudos revelam que os intervenientes da via miRNA que são simultaneamente componentes dos P-bodies causam supressão da replicação do HIV-1, nomeadamente a proteína TNRC6A (também conhecido por GW182), a endorribonuclease do tipo III DICER1 (dsRNA-specific endoribonuclease type III), a RNA helicase RCK/p54, e a proteína LSm1 (Sm-like protein 1). Outros componentes dos P-bodies que podem interferir são a RNase nuclear do tipo III RNASEN (RNase III nuclear), a enzima DCP1A (mRNA-decapping enzyme 1A) e o factor EDC4 (Enhancer of mRNA deccaping 4). Como todos os vírus, o HIV-1 depende da maquinaria celular para conseguir replicar-se. Este facto impulsionou estudos cujo objectivo era a identificação de factores celulares associados à replicação do HIV-1. Recentemente, vários autores exploraram como tecnologia um fenómeno biológico no qual pequenas moléculas de RNA de cadeia dupla (double stranded RNA, dsRNA) levam à degradação de mRNAs. Este processo chamado de RNA de interferência (RNA interference, RNAi) tornou-se uma ferramenta útil, podendo ser usados pequenas moléculas de RNAs de interferência (small interfering RNAs, siRNAs) ou pequenos RNAs com formato em hairpin (short hairpin RNAs, shRNAs). Neste contexto foi recentemente realizado um trabalho por Sylvie Rato e colaboradores que, através de um screen de shRNA focado em cinases e fosfatases, identificou 14 proteínas importantes para a replicação do HIV-1, nomeadamente CIB2 e SGK. Ambas as proteínas demonstraram serem importantes numa fase inicial ciclo do HIV-1, antes da integração viral e muito provavelmente na entrada do vírus. SGK (serum/glucocorticoid regulated kinase) é uma cinase que activa certas vias de potássio, sódio e cloro, também dependentes de alguns coreceptores, sugerindo um envolvimento na fusão vírus-célula. CIB2 é uma proteína regulatória de ligação ao cálcio (calcium and integrin binding regulatory protein 2), que parece interagir com integrinas e pode ter um papel importante nos canais iónicos, sugerindo uma influência na fusão vírus-célula. Uma vez que todas as funções de CIB2 são suportadas pela elevada homologia entre CIB2 e CIB1, pensa-se que CIB2 pode também interagir com DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase). DNA-PKcs é a unidade catalítica de um complexo proteico da cinase nuclear DNA-PK que parece estar envolvida na integração e na transcrição do HIV-1. Objectivos Neste estudo pretendeu-se: 1) Identificar novos factores celulares adjuvantes essenciais à replicação do vírus HIV-1 associados às duas vias da imunidade inata, i.e o silenciamento de genes pela via de miRNAs e a via de sinalização de RLH; 2) Avaliar o efeito das proteínas identificadas por Rato e colaboradores no ciclo viral do HIV-2 e; 3) investigar o mecanismo pelo qual CIB2 e SGK influenciam a fase precoce do HIV-1, mais concretamente na fusão e na transcrição do vírus. Materiais e Métodos Para a construção de clones shRNA, procedeu-se à transdução de células Jurkat por spinoculation, utilizando vectores lentivirais que expressam shRNAs individuais para os genes selecionados das duas vias de imunidade inata em estudo. Os clones individuais foram obtidos pelo método de ClonaCell-TCS e selecionados em meio suplementado com 2 μg/mL de puromicina. Os ensaios de replicação de HIV-1 e HIV-2 foram efectuados após a infecção dos diferentes clones por spinoculation com uma multiplicidade de infecção (Multiplicity of Infection, MOI) de 1. O HIV-1 e o HIV-2 foram produzidos por transfecção, pelo método de fosfato de cálcio dos plasmídeos pHIV-1NL4-3 e pHIV-2ROD em HEK 293T, respectivamente. A transcrição pelo HIV-LTR foi avaliada pela expressão de β-galactosidase após transfecção transiente em células HeLa-P4 com pCMV-Tat, pCMV-CIB2, pLKO.1 shRNA CIB2, pLKO.1 shRNA DNA-PKcs, pLKO.1 shSCRAM, e pcDNA3.1ZEO(+) em diferentes combinações. Para avaliar a fusão vírus-célula, os clones shRNA CIB2 e SGK foram infectados com HIV-1NL4-3 com a enzima Beta-lactamase (BlaM)-Vpr incorporada e posteriormente incubados com o flurocromo CCF2-AM. A degradação do corante pela enzima BlaM após a fusão vírus-célula foi detectada por citometria de fluxo. Resultados Dos 152 shRNA clones obtidos, 19 foram viáveis e destes, 10 foram submetidos a ensaios de replicação. Desta forma foram identificados 4 factores importantes na replicação do HIV-1: RNASEN e ISG15, cuja supressão induziu uma redução da quantidade de vírus detectada; e OTUD5 e TNRC6A cuja supressão induziu um aumento da carga viral. As proteínas previamente identificadas por Rato e colaboradores como factores adjuvantes do HIV-1 também demonstraram ter um papel importante no ciclo replicativo do HIV-2, como se pôde observar pela redução da quantidade viral detectada no sobrenadante dos clones infectados. Em relação a CIB2, os níveis de β-galactosidase obtidos na co-transfecção com CIB2 e Tat foram superiores ao controlo, evidenciando que a sobre-expressão de CIB2 leva ao aumento da transcrição de LTR. Quando quantidades crescentes de CIB2 são transfectadas com quantidades crescentes de shRNA de DNA-PKcs, observa-se uma forte diminuição dos níveis de β-gal que corresponde a uma redução da transcrição do LTR pela Tat. No ensaio de fusão vírus-célula observou-se uma diminuição da percentagem de células que sofreram fusão viral de 20% nas células Jurkat, para 7,65% e 8,10% nos clones shRNA de CIB2 e SGK, respectivamente. Conclusões Os resultados apresentados nesta tese mostram as potencialidades da tecnologia do RNAi para a compreensão da interacção entre factores celulares e o HIV-1. A identificação de factores adjuvantes e de restricção envolvidos na via de silenciamento pelos miRNAs e a via de sinalização de RLH é um passo importante para aprofundar o conhecimento relativamente às defesas antivirais inatas. Além disso, a caracterização de proteínas relevantes no ciclo de replicação do HIV-1, assim como do HIV-2, pode estimular novos estudos relativos à interacção HIV-célula. Desta forma, estes estudos poderão propor novas estratégias antivirais contra a infecção por HIV-1, importantes para encontrar tratamentos mais eficientes para a SIDA