The F-BAR protein NOSTRIN in endothelial signal transduction

NOSTRIN belongs to the family of F-BAR proteins, which are multi-domain adaptor proteins that have emerged as important regulators of membrane remodeling and actin dynamics in a variety of vital cellular processes. They have been analyzed structurally and biochemically and overexpression studies have revealed their potential in inducing membrane curvature and tubulation. Several studies have begun to decipher the function of individual proteins, but the understanding of F-BAR protein functions in vivo is still quite limited. The F-BAR protein NOSTRIN is mainly expressed in endothelial cells and has originally been described as interaction partner of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), modulating eNOS subcellular localization. The phenotypic characterization of NOSTRIN knockout mice revealed decreased nitric oxide (NO) and cGMP levels, an increase in systolic blood pressure and an impairment of the acetylcholine-induced, NO-dependent relaxation of aortic rings from mice with global as well as endothelial cell-specific knockout of the NOSTRIN gene (ECKO) . These findings implied that NOSTRIN plays a role in regulating NO production in vivo, but the underlying molecular mechanisms were unclear. Therefore, this study was aimed at addressing the mechanism causing the inhibited vasodilation specifically upon stimulation with acetylcholine in NOSTRIN KO and ECKO mice, and at exploring additional roles of NOSTRIN in the signal transduction of endothelial cells. The major acetylcholine receptor that mediates vessel relaxation upon stimulation with acetylcholine is the muscarinic acetylcholine receptor subtype M3 (M3R). In the present study NOSTRIN was identified as novel interaction partner of the M3R and important factor for the correct spatial distribution and functionality of the M3R. Moreover, it provides the first example of an F-BAR protein regulating a GPCR. Confocal immunofluorescence microscopy analysis of isolated aortae from NOSTRIN KO and WT mice indicated that NOSTRIN was necessary for the proper subcellular localization of the M3R and targeted it to the plasma membrane. A series of pulldown experiments revealed a direct interaction of NOSTRIN with the M3R. The binding required the SH3 domain of NOSTRIN and the third intracellular loop of the M3R, which has a recognized role in receptor regulation. The interaction of NOSTRIN with the M3R was confirmed by co-localization of NOSTRIN and the M3R upon overexpression in mammalian cells. Expression levels of the M3R as well as eNOS were not affected by the loss of NOSTRIN in accordance with the finding, that NOSTRIN impacts on the acetylcholine/eNOS signaling axis through regulation of the subcellular trafficking of its binding partners. Furthermore, there were first indications for a role of NOSTRIN in facilitating the carbachol-induced calcium response in M3R-expressing cells, suggesting that NOSTRIN might influence M3R activation. in the absence of NOSTRIN, the function of the M3R in mammalian cells overexpressing the M3R was markedly impaired, resulting in abolition of the calcium response to the M3R agonist carbachol. In accordance, the activated eNOS fraction associated with the Golgi complex was markedly reduced in aorta explants from NOSTRIN knockout and ECKO mice. Moreover, NOSTRIN knockout inhibited the carbachol-induced, activating phosphorylation of eNOS in murine aortae as well as primary mouse lung endothelial cells confirming its role as important regulator of eNOS activity in vivo.F-BAR Proteine sind eine Familie von Adapterproteinen, die über verschiedene funktionelle Domänen verfügen und an der Schnittstelle zwischen Membran und Aktinzytoskelett eine Vielzahl essentieller zellulärer Prozesse regulieren. Die strukturellen und biochemischen Eigenschaften einer Reihe von F-BAR Proteinen wurden bereits detailliert untersucht und Überexpressionsstudien belegen die Fähigkeit von F-BAR Proteinen, Membrankrümmungen und kleine Membrankanäle zu erzeugen. Das Wissen über die spezifische Funktion einzelner F-BAR Proteine in vivo ist hingegen noch immer begrenzt. Das F-BAR Protein NOSTRIN wird vor allem von Endothelzellen exprimiert und wurde ursprünglich als Interaktionspartner und Regulator der subzellulären Lokalisation der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) beschrieben. NOSTRIN-KO-Mäuse weisen erniedrigte Stickstoffmonoxid (NO) und cGMP-Spiegel, einen erhöhten systolischen Blutdruck und eine deutliche Beeinträchtigung der acetylcholinabhängigen Relaxation isolierter Aortenringe auf, was darauf hindeutet, dass NOSTRIN eine wichtige Rolle in der Regulation der NO-Produktion in vivo spielt. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war, den molekularen Mechanismus aufzuklären, der der Beeinträchtigung der acetylcholin-abhängigen Vasorelaxation zugrunde liegt, und darüberhinaus weitere mögliche Funktionen von NOSTRIN in der Signaltransduktion von Endothelzellen zu untersuchen. Die acetylcholinabhängige Vasorelaxation wird über den muskarinergen Acetylcholinrezeptor vom Subtyp M3 (M3R) vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde NOSTRIN als neuer Interaktionspartner des M3R identifiziert. Dies stellt die erste Beschreibung eines F-BAR Proteins als Regulator eines GProtein-gekoppelten Rezeptors dar. Mit Hilfe von konkofaler Immunfluoreszemzmikroskopie an Aortenexplantaten konnte nachgewiesen werden, dass NOSTRIN für die korrekte räumliche Lokalisation des M3R an der Plasmamembran von Endothelzellen verantwortlich ist. Mit einer Reihe von Pulldown-Experimenten wurde die Wechselwirkung von NOSTRIN mit dem M3R als eine direkte Protein-Protein-Interaktion charakterisiert. Die Interaktion wird über die SH3-Domäne von NOSTRIN und die dritte intrazelluläre Schleife des M3R vermittelt, welche eine wichtige Rolle in der Regulation der Rezeptorfunktion einnimmt. Die Interaktion von NOSTRIN mit dem M3R wurde zusätzlich durch die Kolokalisation der beiden überexprimierten Proteine in Säugerzellen bestätigt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NOSTRIN keinen Einfluss auf die Expression des M3R hat, was unterstreicht, dass NOSTRIN die Acetylcholin/eNOS-Signalkaskade durch die Regulation der subzellulären Lokalisation seiner Interaktionspartner beeinflusst. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit gaben zudem erste Hinweise darauf, dass NOSTRIN den Carbachol-induzierten Kalziumeinstrom in M3Rexprimierenden Zellen ermöglicht. Das deutet darauf hin, dass NOSTRIN die Funktionalität des M3R beeinflusst. In Übereinstimmung damit war die Carbachol-induzierte aktivierende Phosphorylierung der eNOS in Aorten und primären Endothelzellen in der Abwesenheit von NOSTRIN inhibiert und die mit dem Golgi-Apparat-assozieerte eNOS-Fraktion im NOSTRIN-KO und –ECKO deutlich reduziert. NOSTRIN stellt somit einen neuen, wichtigen Interaktionspartner des M3R dar und der Verlust von NOSTRIN beeinträchtigt die dem M3R nachgeschalteten Signalwege, einschliesslich der Aktivierung der eNOS. Bei der Untersuchung weiterer Funktionen von NOSTRIN wurde in Endothelzellen von NOSTRIN-KO-Mäusen eine Beeinträchtigung der Anordnung von kortikalem Aktin, Aktin-Stressfasern und der PECAM-1-Membranfärbung beobachtet. Sowohl das Aktinzytoskelett als auch PECAM-1 sind maßgeblich an der Reaktion der Endothelzellen auf Schubspannung beteiligt. Um der Frage nachzugehen, ob NOSTRIN an der Ausbildung und Ausrichtung von Stressfasern in Richtung des Blutflusses beteiligt ist, wurde eine Flusskammer gebaut. Mit Hilfe dieser konnten Aortenexplantate definiertem Fluss entweder in der physiologischen Flussrichtung oder rechtwinklig dazu ausgesetzt werden. Immunofluoreszenzfärbungen der Aortenexplantate ergaben Hinweise darauf, dass die Fähigkeit der Endothelzellen, ihren Zellkörper und ihre Stressfasern mit der Flussrichtung auszurichten, in Aorten von NOSTRIN-KO-Mäusen beeinträchtigt war. Diese Daten bilden die Grundlage für zukünftige Studien zur Rolle von NOSTRIN bei der Mechanotransduktion in Endothelzellen