Characterization of endothelial nitric oxide synthase activation by sphingosine-1-phosphate agonists

Das Endothel hat eine zentrale Rolle in der vaskulären Homöostase, und pathologische Änderungen in diesem Gewebe bedingen die Entstehung und Aufrechterhaltung chronisch entzündlicher Atherosklerose. Endogene Sphingolipide, wie Sphingosin-1-Phosphat, wirken in diesem Zusammenhang anti- inflammatorisch, indem sie über verschiedene G-Protein-gekoppelte S1P- Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) aktivieren. Stickstoffmonoxid seinerseits wirkt vasodilativ und atheroprotektiv. Bislang kam in diesem Kontext synthetischen Sphingosin-1-Phosphat-Agonisten eine kontroverse Rolle bei der Aktivierung verschiedener S1P-Rezeptoren zu. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb das vasoaktive Potential des selektiven S1P1-Agonisten AUY954 sowie das von pFTY720 getestet, welches agonistisch an S1P1/3 in Endothelzellen wirkt. Beide verwendeten Agonisten, AUY954 und pFTY720, führten zu einer konzentrations- und zeitabhängigen Stickstoffmonoxid-Produktion, welche in Endothelzellen fluoreszenzmikroskopisch gemessen werden konnte. In der Folge konnte die Akt- abhängige eNOS-Phosphorylierung an dem aktivierenden Aminosäurerest Ser1177 detektiert werden. Der Einsatz des kompetitiven eNOS-Inhibitors L-NAME sowie eines Akt-Inhibitors blockierten eine NO-Produktion vollständig. Die Nutzung der S1P-Antagonisten W146, CAY10444 und VPC23019 sowie die Messungen an Zellen nach knock-down von S1P-Rezeptoren ergaben eine unterschiedliche Rezeptoraktivierung für AUY954 und pFTY720. Während durch Stimulation mit AUY954 über selektive S1P1-Aktivierung eine potente Stickstoffmonoxid- Generation gemessen werden konnte, ergab sich für pFTY720 eine komplexere - möglicherweise kooperative - Aktivierung über S1P1/3. Die vasodilative Relevanz von AUY954 ließ sich in physiologischen Messungen an isoliert perfundierten Nieren bestätigen. Für pFTY720 hingegen konnten lediglich vasokonstriktive Effekte gemessen werden, die abermals eine komplexere Wirkweise vermuten lassen. Zusammenfassend könnte dem Einsatz von AUY954 eine bedeutende Rolle für den immunologischen und antiapoptotischen Schutz von Endothelzellen zukommen und die klinische Anwendung in immunsuppressiven und antiatherogenen Therapiestrategien weniger unerwünschte Arzneimittelwirkungen und eine bessere pharmakologische Kontrollierbarkeit mit sich bringen als das bereits klinisch erprobte pFTY720.The endothelium has a central role in vascular homoeostasis, and pathological changes in this tissue cause the development and maintenance of chronic inflammatory atherosclerosis. Endogenous sphingolipids, such as spingosine-1-phosphate, in this context have anti-inflammatory properties by interacting with different G-protein coupled S1P-receptors that activate the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Nitric oxide in turn is vasodilative and atheroprotective. So far, synthetic agonists of sphingosine-1-phosphate have played a controversial role in terms of different S1P-receptor activation. Here, the vasoactive potential of the S1P1-selective agonist AUY954 and that of pFTY720, which acts agonistically on S1P1/3 in endothelial cells, was tested. Both agonists, AUY954 and pFTY720, led to a dose- and time- dependent production of nitric oxide that could be measured in endothelial cells using fluorescence microscopy. Subsequently, Akt-dependent eNOS phosphorylation of the Ser1177 binding site was detected. Use of L-NAME, a competitive eNOS-inhibitor, as well as utilization of an Akt-inhibitor led to a complete blockage of NO production. Usage of the S1P-antagonists W146, CAY10444 and VPC23019 as well as measurements in S1P-receptor knock-down cells revealed a different receptor activation upon stimulation with AUY954 and pFTY720. Whereas selective S1P1 activation with AUY954 led to a powerfull nitric oxide generation, a more complex potentially cooperative - activation upon pFTY720 treatment was observed. The vasodilative relevance of AUY954 was verified in physiological measurements of isolated perfused kidneys. Upon pFTY720 usage on the other hand only vasoconstrictive properties could be measured, which again refer to a more complex activation effect. In summary, the use of AUY954 might have a crucial role in the immunological and anti- apoptotic protection of endothelial cells and its clinical utilization in immunosuppressive and anti-atherogenic therapies might have less side effects and be better pharmacologically controllable than that of pFTY720, which has already been clinically proven