New molecular mechanisms of cellular interactions at the vascular wall und their impact on the pathogenesis of atherosclerosis

Hintergrund: EMMPRIN (Extracellular matrix metalloproteinase Inducer) ist ein immunglobulinähnliches Glykoprotein, das auf verschiedenen Zellen exprimiert wird. Erstmals beschrieben wurde EMMPRIN auf Tumorzellen. Zwischenzeitlich ist bekannt, dass EMMPRIN auch auf verschiedenen weiteren Zellen (z.B. auf Fibroblasten, Monozyten oder glatten Muskelzellen) exprimiert wird. Erst vor kurzem konnte eine aktivierungsabhängige Expression von EMMPRIN nun auch auf Thrombozyten nachgewiesen werden. Funktionell war EMMPRIN bislang ausschließlich als Signalrezeptor bekannt, der über zelluläre homotypische EMMPRIN-EMMPRIN- Interaktionen die Freisetzung plaquedestabilisierender Matrix Metalloproteinasen (MMPs) induzieren kann. In dieser Arbeit ist es gelungen, thrombozytäres Glykoprotein VI (GPVI) als neuen Rezeptor von EMMPRIN zu identifizieren, über deren Wechselwirkung Adhäsionsvorgänge vermittelt werden. Darüber hinaus wurden in vorliegender Arbeit Interaktionen von EMMPRIN mit seinem ebenfalls in der atherosklerotischen Plaque exprimierten Liganden Cyclophilin A (CyPA) und deren Bedeutung für die Progression der Atherosklerose untersucht. Methoden und Ergebnisse: Isolierte humane Thrombozyten wurden mit ADP vorstimuliert und unter arteriellen Flussbedingungen (2000 –1) über immobilisiertes rekombinantes EMMPRIN-Fc oder Kontroll-Fc-Fragment perfundiert. Dabei zeigten ADP-stimulierte Thrombozyten auf immobilisiertem EMMPRIN-Fc gegenüber Fc eine signifikante Aufregulation ihres „Rolling“-Verhaltens, wohingegen in Hinblick auf feste Adhäsion kein Unterschied auszumachen war. Wurden die Thrombozyten mit den blockierenden monoklonalen Antikörpern (mAk) anti-EMMPRIN oder anti-GPVI vorbehandelt, zeigte sich eine signifikante Reduktion des beobachteten „Rollings“. Dagegen hatte eine Vorbehandlung mit den blockierenden mAk anti-P-Selektin, anti-alpha4-Integrin oder anti-GPIIb/IIIa keinen Effekt. Vielmehr zeigten mit GPVI transifizierte Ovarialzellen chinesischer Hamster (CHO-Zellen), verglichen mit nicht transfizierten CHO-Zellen, ein gesteigertes „Rolling“ (aber keine gesteigerte feste Adhäsion) auf immbolisiertem EMMPRIN-Fc. Ebenso konnte bei mit EMMPRIN transifizierten CHO-Zellen gegenüber nicht transfizierten CHO-Zellen ein vermehrtes „Rolling“ auf immbolisiertem GPVI-Fc, sowie immobilisiertem EMMPRIN-Fc nachgewiesen werden. Mit ELISA, sowie Oberflächenplamonenresonanzmessungen konnte die Spezifität und Affinität einer Bindung zwischen EMMPRIN und GPVI gezeigt werden. Mittels Immunhistologie (anti-EMMPRIN, anti-CyPA, Isotyp-Kontrolle, van Gieson) von Gefäßabschnitten aus Aortenbögen ApoE-defizienter Mäuse konnte eine Ko-Expression von EMMPRIN und CyPA mit betonter Lokalisation in der vulnerablen „Plaqueschulter“ dargestellt werden. Zymographisch ließ sich in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es nach Inkubation mit 100 nM CyPA ebenso wie nach Inkubation mit 50 ug/ml EMMPRIN-Fc zu einer signifikant gesteigerten Freisetzung der matrixdegradierenden MMP-9 aus isolierten humanen Monozyten, wie auch aus isolierten humanen Schaumzellen kommt, die sich durch eine Vorbehandlung der entsprechenden Zellen mit dem blockierenden mAk anti-EMMPRIN, verglichen mit Kontroll-IgG, jeweils wirkungsvoll inhibieren ließ. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Messungen konnte in dieser Arbeit auch erstmals gezeigt werden, dass CyPA EMMPRIN-abhängig humane Thrombozyten aktiviert. Nach 30-minütiger Inkubation von Thrombozyten mit 100 nM CyPA zeigte sich durchflusszytometrisch eine signifikante Aufregulation der thrombozytären Expression von P-Selektin, EMMPRIN und SDF-1. Anhand des thrombozytären Aktivierungsmarkers CD62P konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass es sich um einen EMMPRIN-vermittelten Aktivierungsprozess handeln könnte, da nach Vorinkubation mit dem blockierenden mAk anti-EMMPRIN, verglichen mit der Vorinkubation mit Kontroll-IgG, eine derartige thrombozytäre Stimulation nicht beobachtet werden konnte. Zusammenfassung: Thrombozytäres EMMPRIN ist ein neuer Rezeptor für GPVI, der über EMMPRIN-GPVI-, sowie EMMPRIN-EMMPRIN-Interaktionen thrombozytäres Rolling vermittelt. EMMPRIN und sein Ligand CyPA werden vorwiegend in der "Schulter" atherosklerotischer Plaques exprimiert. CyPA und rekombinantes EMMPRIN-Fc induzieren über Bindung an EMMPRIN-Rezeptoren eine Steigerung der proteolytischen Aktivität humaner Monozyten und Schaumzellen durch gesteigerte Freisetzung der matrixdegradierenden MMP-9. CyPA aktiviert EMMPRIN-abhängig humane Thrombozyten und führt zu einer Aufregulation der thrombozytären Oberflächenexpression von P-Selektin, EMMPRIN und SDF-1. Diese Ergebnisse unterstreichen Bedeutung von EMMPRIN für eine fortschreitende Inflammation der Gefäßwand, sowie zelluläre Interaktionen, die mit der Progression der Atherosklerose bis hin zu Plaqueruptur und Gefäßokklusion einhergehen.Background: The Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN) is a cell surface glycoprotein and belongs to the immunoglobulin superfamily. It was first described on tumor cells and is also expressed on various other cell types (e.g. fibroblasts, monocytes, smooth muscle cells). During cellular interactions homotypic EMMPRIN-EMMPRIN interactions are known to induce the synthesis of matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs are thought to induce plaque rupture in atherosclerosis leading to vascular occlusion associated with e.g. stroke or myocardial infarction. Recently, we have identified EMMPRIN as a novel platelet receptor which becomes upregulated upon platelet activation. The aim of this study was to identify a second platelet receptor for EMMPRIN (apart from EMMPRIN itself) and to study, if EMMPRIN can also function as an adhesion receptor in addition to its known signaling function. Furthermore expression and functional role of EMMPRIN and its ligand Cyclophilin A (CyPA) in atherosclerotic plaques should become identified. In addition to characterization of EMMPRIN and CyPA in atherosclerotic plaques their interaction was investigated with regard to MMP-expression in foam cells and platelet activation. Methods and results: Isolated human platelets were prestimulated with ADP and perfused over immobilized recombinant EMMPRIN-Fc or Fc-fragments under arterial shear conditions (2000 –1). ADP-stimulated platelets showed significantly enhanced rolling (but not enhanced firm adhesion) on immobilized EMMPRIN-Fc compared to Fc. Pretreatment of platelets with blocking monoclonal antibodies (mAbs) anti-EMMPRIN or anti-glycoprotein VI (GPVI) lead to a significant reduction of rolling platelets on immobilized EMMPRIN-Fc, whereas pretreatment with blocking mAbs anti-P-selectin, anti-alpha4-integrin or anti-GPIIb/IIIa had no effect. Consistently, chinese hamster ovary (CHO) cells stably transfected with GPVI showed enhanced rolling (but not adhesion) on immobilized EMMPRIN-Fc in comparison to non-transfected CHO cells. Similarly, CHO cells stably transfected with EMMPRIN showed enhanced rolling on immobilized GPVI-Fc (or EMMPRIN-Fc) compared to non transfected CHO-cells. Finally, specific binding of EMMPRIN to GPVI was demonstrated by a modified ELISA and surface plasmon resonance technology with a dissociation constant of 88 nM. For investigation for the functional relevance of EMMPRIN-CyPA interactions in atherosclerotic plaques ApoE-deficient mice were sacrificed and atherosclerotic plaques of the aortic arch were analyzed by in situ immunostaining (van Gieson, anti-EMMPRIN, anti-CyPA, isotype control) revealing both strong EMMPRIN and CyPA expression in atherosclerotic plaques with predominant localization in the vulnerable plaque shoulder. The important role of EMMPRIN for the regulation of MMPs lead us to investigate whether its ligands soluble CyPA or/and soluble recombinant EMMPRIN can further induce the activation of plaque destabilizing MMP-9 in monocytes and foam cells. In fact, incubation of monocytes and foam cells for 24 hours with recombinant CyPA or EMMPRIN-Fc induced the secretion of MMP-9 into the cell culture supernatant of monocytes or monocyte-derived foam cells to a similar extent as achieved by lipopolysaccharide. The CyPA-induced activation was abrogated by an EMMPRIN-blocking antibody indicating that EMMPRIN is involved in this activation process. The EMMPRIN-dependent platelet activation by CyPA was analyzed via flow cytometry. Platelets incubated with CyPA for 30 min showed a significantly increased surface expression of SDF-1, EMMPRIN (CD147) and P-selectin (CD62P) which was also abrogated by preincubation with an EMMPRIN-blocking antibody. Conclusions: Platelet glycoprotein VI (GPVI) is a novel receptor for EMMPRIN and can mediate platelet rolling via GPVI-EMMPRIN interaction. EMMPRIN and its ligand cyclophilin A are predominantly expressed in the shoulder of atherosclerotic plaques. Monocytes and monocyte-derived foam cells express EMMPRIN, which mediates CyPA-induced plaque destabilizing MMP-9 activity. CyPA activates platelets in an EMMPRIN-dependent manner. Taken together, EMMPRIN may represent a promising target in atherosclerosis to prevent inflammatory activities at the vascular wall leading to progression of atherosclerosis and plaque rupture