Molecular mechanisms of opioid receptor mediated signal transduction under inflammatory condition

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1\. Einleitung 1 2\. Problemstellung 11 3\. Material und Methoden 12 4\. Quantitative Analyse der Ligand-Bindungsstudien 26 5\. Ergebnisse 34 6\. Diskussion 58 7\. Zusammenfassung 70 8\. Summary 72 9\. Literaturverzeichnis 74 10\. Publikationen 82 11\. Danksagung 83Opioidrezeptoren (μ,δ, und κ) werden nicht nur im zentralen Nervensystem, sondern auch in primär sensorischen Neuronen exprimiert. Diese Rezeptoren werden in den Spinalganglien synthetisiert und über die Axone sowohl zum peripheren als auch zum zentralen Nervenende primär sensorischer Neurone transportiert. Eine analgetische Wirkung von Opioiden wird durch Aktivierung von µ-Opioidrezeptoren (MOR) nicht nur im zentralen (ZNS), sondern auch im peripheren Nervensystem (PNS) hervorgerufen. Zahlreiche klinische und tierexperimentelle Studien zeigen, dass auch die lokale Gabe von Opioiden eine analgetische Wirkung sowohl bei akuten als auch bei chronischen Schmerzen bewirkt. Peripher analgetische Wirkungen von Opioiden sind besonders in entzündetem, schmerzhaften Gewebe nachweisbar und nehmen mit der Dauer und der Ausprägung der Entzündung kontinuierlich zu. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Veränderungen der MOR-Expression bzw. der MOR- Signaltransduktionskaskade unter Entzündungsbedingungen die Zunahme der peripher analgetischen Wirkung von Opioiden erklären könnten. Die Untersuchungen wurden an peripheren und zentralen Neuronen von Wistar Ratten, bei denen mit Hilfe von Freund's complete adjuvant (FCA) eine Entzündung der Rattenhinterpfote induziert wurde, durchgeführt. Mittels Autoradiographie bzw. Immunhistochemie wurde die Verteilung und die Intensität der MOR in supraspinalen, spinalen und peripheren Gewebeschnitten analysiert. In Ligandenbindungsstudien wurde die Anzahl exprimierter MOR unter Entzündungsbedingungen gemessen. In funktionellen Untersuchungen konnte mit Hilfe des [35S]GTPγS-Assays die Bedeutung der Entzündung für die MOR- Signaltransduktion untersucht werden. In Verhaltensexperimenten wurden die peripher analgetischen Wirkungen des partiellen MOR-Agonisten Buprenorphin (BUP) in Tieren mit und ohne Pfotenentzündung untersucht. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass eine lokale Entzündung eine Zunahme der Anzahl der exprimierten MOR in Spinalganglion (DRG) jedoch nicht in Hypothalamus (HT) oder Rückenmark (RM) hervorrufen konnte. Diese Zunahme war zeitabhängig und erreichte ihr Maximum nach 24 Stunden. Der Anstieg der MOR- Expression in DRG war auf entzündete Seite beschränkt und bevorzugt in kleinzelligen Neuronen zu finden. Dies ging mit einer vermehrten G-Protein Kopplung einher. Im Vergleich zu normalen Bedingungen konnte der MOR Agonist DAMGO eine vermehrte G-Protein- Kopplung in DRG unter entzündlichen Bedingungen induzieren, wobei es zu keiner signifikanten Veränderung der MOR G-Protein-Kopplung in HT und RM kam. Hingegen konnte BUP nur in DRGs von Tieren mit Entzündung im Gegensatz zu Tieren ohne Entzündung eine nachweisbare G-Protein-Kopplung induzieren. In Verhaltenexperimenten bewirkte eine lokale Gabe von BUP einen analgetischen Effekt lediglich in der entzündeten Pfote aber nicht in der gesunden Pfote. Diese beobachteten Veränderungen unterstreichen die bedeutsamen Unterschiede in Opioidrezeptor-Bindung und G-Protein Kopplung zwischen entzündetem und nicht-entzündetem Gewebe. Diese Befunden könnten eine Verbesserte Analgesie unter Entzündungsbedingungen erklären. In Anbetracht der aktuellen Entwicklung neuartiger, peripher selektiver Opioide können die vorliegenden Ergebnisse zum gezielten Einsatz dieser Medikamente und dem Verständnis der molekularen Mechanismen der Schmerzhemmung in entzündetem Gewebe beitragen.Opioid receptors (μ,δ, und κ) are synthesized in dorsal root ganglia (DRG) and transported into peripheral terminals of primary afferent neurons. Opioids mediate their analgesic effects by activating µ opioid receptors (MOR) not only within the central (CNS) but also on peripheral nervous system (PNS). The peripheral analgesic effects of opioids are best described under inflammatory conditions and has been shown in clinical and experimental studies. The current thesis investigated changes of the (MOR) expression and/or signaling at peripheral, spinal, or supraspinal neurons in an animal model of intraplantar Freund's complete adjuvant (FCA)-induced inflammation. Therefore, this study compared animals with and without inflammation to examine whether FCA inflammation 1) leads to differences in the distribution and density of MOR on peripheral, spinal, or supraspinal neurons 2) alters MOR binding on peripheral, spinal, or supraspinal neurons, 3) causes differences in the potency and efficacy of agonist coupling to MOR on peripheral, spinal, or supraspinal neurons, or 4) reveals differences in behavioral studies for the partial MOR agonist buprenorphin (BUP). Our results show that painful inflammation leads to differential alterations of MOR receptor expression in Hypothalamus (HT), spinal cord (SC) and DRG. Unilateral FCA inflammation of one hindpaw induced a significant upregulation of MOR receptor sites only in DRG but not in HT or SC. This upregulation was time-dependent, restricted to the inflamed side, and showed a peak at 24 h. It is associated with an upregulation of MOR receptor expression mainly in small sized primary afferent neurons, but not in the CNS. This suggests that a locally applied inflammation can affect neurons that are innervating the region of inflammation. This has functional relevance because the efficacy of MOR receptor agonists in G protein coupling is enhanced in these primary afferent fibers. Inflammation resulted in significant increases in the voll agonist (DAMGO) induced MOR receptor G protein coupling only in membranes of DRG, but not in HT, SC, or DRG on the contralateral side of inflammation. In contrast, the partial agonist (BUP) showed no detectable G-protein coupling in DRG of animals without FCA inflammation; however, partial agonist activity of BUP-induced MOR G-protein coupling was detectable in animals with FCA inflammation. In behavioral studies administration of BUP produced significant antinociception only in inflamed but not in noninflamed paws. These findings indicate that clinical treatment of patients with opioids in inflammatory diseases is different from patients with noninflammatory painful conditions. The known increased analgesic efficacy of locally applied opioids could be explained by a selectively increased numbers as well as G protein coupling efficacy of MOR receptor in primary afferent neurons