Plant derived Sweet and Ice Structuring proteins as new tools in food processing

Among bioindustries, agribusiness is one of the most important application of biotechnology. The aim of this work is the design and production of recombinant proteins to improve food quality. Food quality comprises various aspects such as the conservation process, generally understood as shelf-life, the physical (e.g. color, texture, taste) and nutritional properties of food or the ability to produce food suitable for people with food intolerances or specific diseases. Since sucrose over-intake has been implicated in different pathologies such as obesity, caries, and diabetes mellitus, our first research topic was a non-calorigenic protein sweetener. Among the sweet-tasting proteins isolated until now, brazzein seems to be the most promising one. The limited availability of the natural brazzein source has rendered large-scale production of brazzein from its natural source not viable. Recombinant DNA technology provides a feasible and cheaper alternative for mass production. Therefore, we develop an efficient method for brazzein inducible or constitutive expression in the GRAS (Generally Recognized As Safe) yeast Pichia Pastoris; about 200 mg of brazzein was obtained from a 1.5 liter fermentation volume. A safe and low cost purification process was optimized taking advantage of cation exchange chromatography, resulting in a final brazzein purity of 99.98 %. The purified protein was then characterized by several techniques: mass spectrometry, calorimetry and NMR analysis were performed to evaluate respectively the mass/post-translational modifications present in the final product, and the thermal stability of brazzein; NMR experiments were also performed to confirmed the structural similarity of the recombinant brazzein with the wild-type brazzein extracted from the natural plant; a taste panel assay for sweet taste control allowed us to determine the sweetness potency of the produced recombinant protein; finally, we evaluated the allergenic potential of brazzein by sequence analysis and pepsin digestion. With regard to an improvement of the shelf-life and of the physical properties of food we focused our attention on a protein suitable for frozen food applications. In particular we are interested in the inhibition of ice recrystallization, a phenomenon by which larger ice crystals grow at the expense of smaller ones at temperature close to 0 °C. The ability of ISPs (Ice Structuring Proteins; that protect organisms that live in sub-zero environments from the deleterious effects of ice crystals’ formation in cells) to retard ice recrystallization makes them suitable for the food industry as natural ice modulators for cold storage of frozen products such as ice cream. In particular, plant ISPs are good inhibitors of the ice-recrystallization process compare to other ISPs (e.g. fish and insect ISPs). Therefore, we identified a promising wheat (Triticum aestivum) ISP and we did the first steps towards the development of an expression method for its industrial production. To perform preliminary studies we expressed this ISP in different Escherichia coli strains, obtaining a very low quantity of the recombinant protein, which precipitated in the pellet during the purification process. Hence, in order to obtain high levels of soluble recombinant ISP, we moved to the P. pastoris expression system. We constitutively expressed different form of this protein: with or without an histidine tag at the C-terminus, and with or without the Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal. Thanks to experiments on a small scale we determined that only the wild type protein with the α-factor was expressed, and that its observed molecular weight is comparable with the expected one. Future development will be the scale-up of the process, the optimization of a purification protocol, and the characterization of the produced protein. Finally, in order to study the possible applications of an ISP as ingredient in the food industry or as cryoprotectant in medicine (another scope for ISPs application), we set up an experimental approach to evaluate the ice recrystallization inhibition activity and the cryopreservation ability of different ISP sources (wheat extract, and type I and II fish ISPs).Tra le bioindustrie quella agroalimentare rappresenta uno dei campi più importanti di applicazione delle biotecnologie. Obiettivo di questo lavoro è la progettazione e produzione di proteine ricombinanti al fine di migliorare la qualità del cibo. La qualità può interessare diversi aspetti come ad esempio il processo di conservazione intesa come shelf-life (‘vita di scaffale’, ossia il periodo durante il quale un prodotto può essere tenuto presso un punto vendita al dettaglio senza che vengano alterate le sue qualità), le proprietà fisiche (es. colore, consistenza, sapore) e nutrizionali dell’alimento, o la possibilità di produrre cibi adatti a persone con intolleranze alimentari o con particolari malattie. Dato che un eccessivo consumo di saccarosio è implicato in varie patologie come ad esempio l’obesità, le carie e il diabete, il nostro primo tema di ricerca si è focalizzato su una proteina dolcificante non-calorica. Tra le proteine dolcificanti isolate finora, la brazzeina sembra essere la più promettente. La disponibilità limitata della fonte naturale di brazzeina ha reso economicamente non sostenibile la sua produzione su scala industriale a partire dalla fonte naturale. La tecnologia del DNA ricombinante costituisce un’alternativa praticabile e più economica per la produzione su ampia scala. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo efficiente per l’espressione inducibile o costitutiva della brazzeina nel lievito GRAS (Generally Recognized As Safe) Pichia Pastoris; circa 200 mg di brazzeina sono stati ottenuti da un volume di fermentazione pari a 1.5 litri. Abbiamo inoltre ottimizzato un processo di purificazione sicuro ed economico mediante cromatografia a scambio cationico, ottenendo la brazzeina con una purezza finale pari al 99.98 %. La proteina purificata è stata poi caratterizzata mediante divere tecniche: spettrometria di massa, analisi calorimetriche e NMR sono state effettuate per valutare rispettivamente la massa e le modifiche post-traduzionali presenti nel prodotto finale, e la stabilità termica della proteina; analisi NMR sono state effettuate anche per confermare la similarità di struttura della proteina prodotta per via ricombinante, con quella della proteina wild-type direttamente estratta dalla pianta; un saggio per determinare l’intensità del gusto dolce ci ha permesso di definire la ‘sweetness potency’ della brazzeina ricombinante; abbiamo infine analizzato il potenziale allergenico della brazzeina mediante analisi della sua sequenza amminoacidica e digestione con l’enzima gastrico pepsina. Per quanto riguarda il miglioramento della shelf-life e delle proprietà fisiche dei cibi, abbiamo concentrato la nostra attenzione su una proteina interessante per l’applicazione in prodotti surgelati. In particolare siamo interessati all’inibizione della ricristallizzazione, fenomeno che causa la formazione di grandi cristalli di ghiaccio a spese di cristalli piccoli a temperature vicine ai 0 °C. L’abilità delle ISPs (Ice Structuring Proteins; proteine che proteggono gli organismi che vivono a temperature inferiori allo zero dagli effetti deleteri della formazione di cristalli di ghiaccio nelle cellule) di inibire il fenomeno della ricristallizzazione le rende interessanti per l’industria alimentare come naturali modulatori del ghiaccio per la conservazione di prodotti surgelati come ad esempio il gelato. In particolare, è stato visto che le ISPs di pianta sono degli ottimi inibitori della ricristallizzazione del ghiaccio. Abbiamo pertanto identificato una promettente ISP di grano (Triticum aestivum) e abbiamo fatto i primi passi verso lo sviluppo di un metodo di espressione per la sua produzione a livello industriale. Al fine di effettuare degli studi preliminari abbiamo espresso la ISP in diversi ceppi di Escherichia coli, ottenendo però una piccolissima quantità di proteina ricombinante che, oltretutto, precipita nel pellet durante il processo di purificazione. Quindi, al fine di ottenere alti livelli di ISP solubile, siamo passati al sistema di espressione costitutiva in P. pastoris. La proteina è stata espressa in diverse forme: con e senza coda di istidine al C-terminale, e con e senza il fattore di secrezione α-factor di Saccharomyces cerevisiae. Grazie a esperimenti su piccola scala abbiamo determinato che solamente la proteina wild type con l’α-factor viene espressa, e che il suo peso molecolare osservato è comparabile con quello atteso. Sviluppi futuri riguarderanno lo scale-up del processo di espressione, l’ottimizzazione di un protocollo di purificazione e la caratterizzazione della proteina prodotta. Per concludere, al fine di studiare la possibile applicazione di una ISP come ingrediente nell’industria alimentare o come crioprotettore in medicina (altra possibile applicazione delle ISPs) abbiamo messo a punto un protocollo sperimentale per valutare l’attività di inibizione della ricristallizzazione e l’abilità di criopreservazione di differenti fonti di ISPs (estratto di grano, ISPs di tipo I e II di pesce)