Structural and functional analysis of gluten protein involved in wheat technological and nutritional properties

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIl frumento è stato da sempre per l’uomo una delle sue più importanti fonti di approvvigionamento perché dotato di peculiari caratteristiche nutrizionali e tecnologiche. Le proprietà tecnologiche degli impasti da esso ottenuti sono dovute principalmente alle proteine del glutine, che è composto da gliadine (monomeriche) e glutenine (polimeriche) che interagiscono tra loro mediante legami idrogeno e legami covalenti tra i residui cisteinici. In particolare, le dimensioni e la quantità di polimeri gluteninici sono i maggiori determinanti delle proprietà tecnologiche degli impasti. Dato che le dimensioni e la struttura dei polimeri gluteninici dipendono anche dal numero e dalla posizione dei residui cisteinici coinvolti nei legami disolfuro, la conoscenza della loro organizzazione permette di comprendere meglio le basi molecolari della qualità degli impasti. Le proprietà nutrizionali dei prodotti a base di frumento sono dovute all’elevata quantità di carboidrati e alle proteine. Queste ultime, pur essendo le responsabili delle qualità tecnologiche, sono causa anche di una grande varietà di allergie e intolleranze nell’uomo. Quindi l’ottenimento di piante a ridotta concentrazione o totale assenza delle classi proteiche coinvolte nelle reazioni avverse risulta essere un buon approccio per l’ottenimento di prodotti maggiormente tollerabili. Lo scopo del lavoro è stato: i) lo studio strutturale di due subunità gluteniniche ad alto peso molecolare (HMW-GS Bx20 e By20) in relazione all’influenza sugli aspetti tecnologici degli impasti e ii) la caratterizzazione proteomica di linee di frumento presentanti delezioni nei geni codificanti le α-gliadine (e le subunità gluteniniche di tipo α, anche note come LMW-GS di tipo C) presenti sui cromosomi 6A e/o 6D in relazione alla celiachia, una delle maggiori reazioni avverse causate dall’ingestione del frumento. Riguardo al primo punto, è stata analizzata la coppia di glutenine ad alto peso molecolare Bx20 e By20, codificata da geni associati presenti al locus Glu-B1, presenti nella cultivar di frumento duro Lira. Sono stati clonati e sequenziati i due geni corrispondenti e dal confronto tra sequenze amminoacidiche dedotte e quelle ottenute tramite spettrometria di massa si è stabilita l’effettiva corrispondenza tra geni clonati e proteine isolate. È stata ottenuta una copertura totale della sequenza proteica HMW-GS Bx20 ed l’83.5% di copertura per la HMW-GS By20. Il confronto tra la struttura di questa coppia di subunità, solitamente associata a caratteristiche tecnologiche negative, e altre coppie di subunità codificate al locus Glu-B1, associate a caratteristiche tecnologiche positive, ha permesso di formulare un’ipotesi riguardo al ruolo del numero e della posizione di cisteine. Successivamente sono stati isolati per riduzioni parziali degli eterodimeri Bx20/By20 e, grazie all’alchilazione differenziale delle cisteine presumibilmente coinvolte nella formazione di legami disolfuro intra- ed intermolecolari, seguita da digestione triptica ed analisi in spettrometria di massa dei peptidi ottenuti, sono state ottenute delle indicazioni riguardo all’organizzazione dei ponti disolfuro all’interno e tra queste sub-unità. Tali dati sono però non conclusivi. Per quanto riguarda il secondo punto, è stato condotto uno studio su delle linee di frumento tenero (cv. Pegaso) nelle quali i geni codificanti per alcune α-gliadine e LMW-GS di tipo C sono mancanti. In particolare è stata utilizzata la linea originale, cv. Pegaso, accanto alle linee da essa derivate, denominate Pegaso 6A- (nella quale risulta deleto il locus Gli-A2), Pegaso 6D- (nella quale risulta deleto il locus Gli-D2) e Pegaso 6A-/6D- (nella quale sono deleti entrambi i loci). E’ stata eseguita l’analisi proteomica (APAGE X SDS-PAGE) differenziale delle gliadine e delle LMW-GS di tipo C. Sono stati identificati sia i polipeptidi presenti/assenti e quindi attribuibili a uno specifico locus genico, che quelli differenzialmente espressi, quelli cioè che hanno subito un effetto pleiotropico. L’identificazione dei polipeptidi mediante spettrometria di massa è in corso. Inoltre, gli estratti gliadinici ottenuti dalle quattro linee sopra citate sono stati sottoposti a digestione chimotriptica e analizzati mediante spettrometria di massa per l’identificazione e la quantizzazione di peptidi noti per essere coinvolti nello scatenamento della malattia celiaca. Questa analisi ha permesso di confermare che, come atteso, le linee in cui i loci Gli-2 sono deleti presentano una minore quantità di peptidi immunogenici. Dato che poi è stato calcolato anche il parametro %UPP (percentuale di proteine polimeriche inestraibili), noto per essere correlato alla forza degli impasti, che non risulta diverso in modo significativo tra le quattro linee, le linee con le delezioni sopra descritte rappresentano un buon materiale di partenza per lo sviluppo di frumenti con una minor quantità di peptidi immunogenici con adeguate performance tecnologiche.Wheat is considered since long time the staple food for man, because it has unique nutritional and technological characteristics. Dough technological properties are mainly due to gluten proteins, which are composed by gliadins (monomeric) and glutenin (polymeric) that interact by hydrogen bonds and covalent bonds between cysteine residues. In particular, the size and the amount of glutenin polymers are the major determinants of dough technological properties. Since the size and the structure of glutenin polymers depend also on the number and position of the cysteine residues involved in disulfide bonds, the knowledge of their organization provides insight into the molecular basis of dough quality. The nutritional properties of wheat-based products are due to the high amount of carbohydrates and proteins. Proteins, even if responsible of the technological quality, are linked to a large number and variety of allergies and intolerances in humans. Thus, obtaining plants with a reduced concentration or a total absence of protein involved in adverse reactions appears to be a good approach for obtaining more tolerable products. The aims of this work were: i) the structural study of the High Molecular Weight gluten-subunit Bx20 and By20 (HMW-GS-Bx20 and HMW-GS-By20) in relationship with the technological aspects of the dough; ii) the proteomic characterization of wheat lines having deletions in α-gliadins genes located on the 6A and/or 6D chromosomes (as well as in the α–type low molecular weight glutenin subunits, that are part of the so-called LMW-GS type C). These genes are related to celiac disease, one of the major adverse reaction in human correlated to wheat. Regarding the first aim, we studied the HMW-GS-Bx20 and HMW-GS-By20 coded by linked genes present at the Glu-B1 locus in the durum wheat cultivar Lira. The coding genes Bx20 and By20 were cloned and sequenced, and the corresponding subunits characterized by a mass spectrometry approach. The comparison between the deduced amino acid sequences and mass spectrometry results was performed. A total coverage of the protein sequence HMW-GS Bx20 and the 83.5% coverage for the HMW-GS By20 were obtained. The comparison between the structural features of Bx20 and By20, generally associated to negative technological properties, and other Glu-B1 coded pairs known to be associated to positive technological properties, allowed us to postulate a hypothesis regarding the role of number and position of the cysteine residues. Afterwards, the Bx20/By20 heterodimers were isolated through partial reductions. Cysteines presumably involved in intra- and intermolecular disulfide bonds were differentially alkylated, trypsin digested and analyzed with mass spectrometry, obtaining indications regarding the organization of the disulfide bonds within and between these subunits. These data are not conclusive at the moment. Regarding the second aim, a study in bread wheat lines obtained from cv. Pegaso in which genes coding for α-gliadins and LMW-GS type C are deleted was conducted. In particular, the wild type cv. Pegaso and its deletion lines Pegaso 6A- (Gli-A2 locus deleted), Pegaso 6D- (Gli-D2 locus deleted) and Pegaso 6A-/6D- (Gli-A2 and Gli-D2 loci deleted) were used. A differentially proteomic analysis (APAGE X SDS-PAGE) of gliadins and glutenins (LMW) type C was conducted, identifying the present/absent proteins linked to a specific locus (either Gli-A2 or Gli-D2 ) and those proteins differentially expressed likely for pleiotropic effects. Moreover, the gliadins extracts, the most likely triggering factor in celiac disease, were chimotrypsin digested and analyzed through mass spectrometry for the identification and quantification of peptides related to this adverse reaction. Results showed that, as expected, the line with Gli-2A deleted loci had a lower amount of immunogenic peptides. Finally, a parameter related to dough technological properties (% UPP) was calculated in Pegaso and its derived deletion lines, by showing no significantly difference. Thus, the deletion lines here analysed represent a good starting plant material in order to develop new wheat genotypes with a lower content of immunogenic peptides and with good technological properties