Engineering robust Saccharomyces cerevisiae yeast for consolidated bioprocessing of lignocellulose into bioethanol

Second generation bioethanol, making use of the polysaccharides included in the lignocellulosic biomass, represents a promising alternative approach to overcome the limitations revealed by first generation bioethanol. The main issue hindering the effective industrial scale utilization of biomass is the lack of low-cost technology. In fact, lignocellulose hydrolysis requires expensive pre-treatments and large dosages of commercial enzymes. Moreover, feedstock pre-treatment results in the formation of inhibitors, mainly weak acids (acetic and formic), furans (furfural and 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde) and phenolics, which affect the fermentation phase. Consolidated BioProcessing (CBP) of lignocellulosic biomass is gaining increasing attention as a potential strategy to reduce production costs both by integrating different production steps and by lowering the need for supplying of commercial cellulases. As no naturally occurring fermenting microorganism suitable for CBP has been described yet, genetic engineering of highly fermentative microorganisms, particularly yeast, will be required. To further improve the economic feasibility of the process in industrial scenarios, the search of robust yeast with high inhibitors tolerance as platform for genetic engineering would be desired. In this study, a collection of wild type Saccharomyces cerevisiae yeast, previously selected for their robustness and high ethanol yield, was characterized for inhibitors tolerance on synthetic mixtures of the inhibitors typical of lignocellulosic pre-hydrolysates and on real pre-hydrolysates, rich in these toxic compounds. The best performing strain was chosen as a robust candidate for the expression of three fungal β-glucosidases by δ-integration, together with the benchmark strain Ethanol Red®, currently utilized in industrial bioethanol production. Similarly, two wild-type yeast that were previously successfully used as parental to develop CBP strains, were used for the same purpose. Among the cellulases required for cellulose degradation, β-glucosidase was selected as it plays a key role in the process, representing the rate limiting enzyme. A large amount of recombinant clones, secreting β-glucosidases from the fungal species Saccharomycopsis fibuligera and Phanerochaete chrysosporium, were obtained. The engineered clones were firstly screened for high enzyme activity in a quantitative assay, using esculin as substrate. The β-glucosidase activity of the best performing strains was then quantified on pNPG. One recombinant able to produce high amounts of β-glucosidase demonstrated to be mitotically-stable and capable of sustaining the growth in presence of cellobiose as sole carbon source. The enzymatic activity of the recombinant was characterized in vitro in terms of enzyme localization, optimal pH and temperature, and stability. The fermentative abilities were assessed in defined medium containing cellobiose. The obtained recombinant showed comparable performances to the parental strain on glucose, indicating that β-glucosidase secretion does not cause any severe metabolic burden to the host. Further, the engineered strain could display high ethanol yield when fermenting cellobiose, comparable to those of a laboratory yeast strain expressing the same β-glucosidase via multicopy episomal plasmid, despite the remarkable disadvantage of lower gene copy number guaranteed by gene integration. This study reports the successful construction of S. cerevisiae strains capable of tolerating high inhibitors concentrations and expressing fungal β-glucosidases. To our knowledge, this work represents the first attempt to produce a CBP microorganism for lignocellulosic bioethanol via integration of β-glucosidases into tolerant yeast selected for thermotolerance and resistance to the inhibitors typically present in lignocellulosic pre-hydrolysates. The fermentation performances of the engineered strain will next be studied on sugarcane bagasse hydrolysate, with the aim to confirm the inhibitors tolerance traits.Il bioetanolo di seconda generazione rappresenta un approccio particolarmente promettente per superare le limitazioni intrinseche del bioetanolo di prima generazione, grazie all’utilizzo dei polisaccaridi presenti nelle biomasse lignocellulosiche. Il principale aspetto che ostacola l’utilizzo in scala industriale della biomassa è rappresentato dalla mancanza di soluzioni tecniche a basso costo. L’idrolisi della lignocellulosa richiede infatti l’impiego di costosi pre-trattamenti e di consistenti quantità di enzimi commerciali. Inoltre il pre-trattamento della biomassa causa la formazione di inibitori, principalmente acidi deboli (acidi acetico e formico), furani (furfurale e 5-idrossimetil-furfurale) e fenoli, che hanno un effetto negativo sulla fase di fermentazione. Il Consolidated BioProcessing (CBP) della biomassa lignocellulosica sta suscitando crescenti attenzioni quale strategia per la riduzione dei costi di produzione, grazie all’integrazione di processi produttivi comunemente distinti e alla riduzione delle quantità degli enzimi commerciali richiesti. Poiché non è ancora stato descritto alcun microrganismo con capacità fermentative in possesso delle caratteristiche necessarie per il CBP, risulta necessario ingegnerizzare microrganismi in possesso di elevate performance fermentative. Al fine di favorire ulteriormente l’applicabilità di questo approccio in ambito industriale, i lieviti da sottoporre al processo di ingegnerizzazione dovranno essere preventivamente selezionati in base alla capacità di tollerare alte concentrazioni di inibitori. In questo lavoro una collezione di lieviti wild-type di Saccharomyces cerevisiae, precedentemente selezionati per robustezza ed elevato tenore fermentativo, è stata caratterizzata per la capacità di tollerare miscele sintetiche degli inibitori tipicamente presenti in nei pre-idrolizzati di origine lignocellulosica. Gli stessi lieviti sono inoltre stati valutati, per le stesse caratteristiche, in pre-idrolizzati non sintetici, ricchi in questi composti. Il ceppo in grado di mostrare le migliori prestazioni è stato scelto per l’espressione di tre β-glucosidasi fungine mediante δ-integrazione, assieme al ceppo di riferimento Ethanol Red®, attualmente utilizzato per la produzione industriale di bioetanolo. Analogamente, sono stati selezionati per lo stesso scopo due lieviti wild-type in precedenza utilizzati con successo per lo sviluppo di ceppi CBP. Tra le cellulasi necessarie per degradare la cellulosa, la β-glucosidasi rappresenta il fattore limitante nel processo, ricoprendo dunque un ruolo chiave nello stesso. E’ stato ottenuto un elevato numero di cloni ricombinanti in grado di secernere β-glucosidasi delle specie fungine Saccharomycopsis fibuligera e Phanerochaete chrysosporium. I cloni ingegnerizzati sono stati in primo luogo selezionati per l’elevata attività enzimatica in un saggio di tipo qualitativo, utilizzando esculina come substrato. L’attività β-glucosidasica dei ceppi più performanti è stata in seguito quantificata su pNPG. Un clone ricombinante, in grado di produrre elevate quantità di β-glucosidasi, è risultato essere mitoticamente stabile e in grado di crescere in presenza di cellobiosio come unica fonte di carbonio. L’attività enzimatica del ricombinante è stata caratterizzata in vitro, relativamente a localizzazione dell’enzima, temperatura e pH ottimali, e stabilità. Le capacità fermentative sono state valutate in presenza di un mezzo di crescita definito contenente cellobiosio. Il ricombinante così ottenuto ha mostrato performance paragonabili a quelle del ceppo parentale in presenza di glucosio, ad indicare che la secrezione di β-glucosidasi non comporta alcun sensibile peso metabolico per l’ospite. Inoltre, il ceppo ingegnerizzato ha mostrato un’elevata resa in etanolo da cellobiosio, paragonabile a quella mostrata da un ceppo di laboratorio in grado di esprimere la medesima β-glucosidasi mediante plasmide episomale multicopia, nonostante il considerevole svantaggio dato dal minor numero di copie geniche permesso dal processo di integrazione cromosomica. Questo studio riporta la costruzione di ceppi di S. cerevisiae in grado di tollerare alte concentrazioni di inibitori e di esprimere β-glucosidasi di origine fungina. In base alla nostra conoscenza, questo lavoro rappresenta il primo tentativo di ottenere un microrganismo CBP per la produzione di bioetanolo di origine lignocellulosica mediante l’integrazione di β-glucosidasi in lieviti selezionati per termotolleranza e per la resistenza agli inibitori comunemente presenti nei pre-idrolizzati lignocellulosici. Le performance fermentative del ceppo ingegnerizzato saranno successivamente studiate su pre-idrolizzato di bagassa di canna da zucchero, al fine di confermare le caratteristiche di tolleranza agli inibitori