Produzione ricombinante, caratterizzazione funzionale e applicazioni biotecnologiche di ossidoresuttasi di origine fungina

The oxido-reductases are enzymes able to catalyze the electron removal from oxidizer to reducer. Laccase and tyrosinase, multicopper enzymes oxidizing phenolic compounds and aromatic diamines by using molecular oxygen as the electron acceptor, belong to the oxido-reductases group. They are enzymes commonly found in plants, fungi, bacteria and insects. Laccase substrates have large versatility and this makes these enzymes highly interesting for various biotechnological and industrial applications. Though laccases and tyrosinases can be directly purified from natural producers, protein recombinant expression in a suitable host organism is the most profitable procedure to obtain, industrially, these enzymes in high quantities and with high purity levels. The presence of oxidative enzyme activities has been also associated to microbial detoxification of olive mill wastewaters (OMWs) after their treatment with selected basidio- and asco-mycetes. The objectives of this study were to characterize genes coding for oxidoreductases in Basidiomycetes, in particular the ERY3 and ERY4 laccase genes of Pleurotus eryingii and the PPO2 gene coding for the Agaricus bisporus tyrosinase, and to select non-conventional yeast able to produce new oxidoreductase enzymes. The ERY3 gene, coding for a P. eryngii laccase, was isolated, cloned and transformed in Saccharomyces cerevisiae cells. The production of recombinant laccase was assayed with a colorimetric test in presence of ABTS, on SDS-PAGE and Western blot analysis. The recombinant yeasts cells were immobilized in calcium alginate beads and the immobilization parameters (inoculum, sodium alginate and CaCl2 concentration) were optimized. The ERY4 laccase gene of P. eryngii was expressed in S. cerevisiae and the recombinant laccase resulted to be not biologically active. This gene was thus modified in order to study the role of its N- and C-terminal regions in determining enzyme catalytic properties. ERY4 gene was subjected to a mutational analysis following these approaches: i) C-terminal progressive deletion to study the role of specific amino acid residues at the C-terminus of Ery4 protein, ii) site-directed mutagenesis of the C-terminal region, iii) chimerical laccases derived from the substitution of both its terminal regions with the corresponding regions of ERY3 gene. The fourteen recombinant genes were separately expressed in S. cerevisiae. 2 Almost all mutant recombinant isoforms showed that they possess enzymatic activity and affinities for different substrates. Genes encoding the laccase isoforms which showed the best enzymatic performances on different substrates, were expressed in S. cerevisiae by displaying the recombinant enzyme on yeast cell surface. The biochemical characterization, immunodetection and Western blot analysis of displayed proteins were performed. To our knowledge, this is the first example of a functional laccase immobilized on yeast surface. The PPO2 tyrosinase gene of Agaricus bisporus was expressed in S. cerevisiae cells and the produced protein was purified by using affinity chromatography and biochemically characterized. To our knowledge, this is the first time that an A. bisporus tyrosinase was expressed in heterologous host S. cerevisiae and in biologically active form. In order to select, from biotechnologically relevant habitat, microorganisms producing oxidoreductases, the effluents from 5 different local olive mills were collected. Three hundred isolates were identified according to their rDNA sequence. Twelve on the 300 identified isolates, belonging to Candida membranifaciens, C. tropicalis, Geotricum candidum, Pichia fermentans, P. holstii and S. cerevisiae species, demonstrated that they were able to use OMW as unique nutrient source for their growth. Phenolic compound concentration and antimicrobial activity was rapidly and significantly decreased by the G. candidum strains. The physiological properties of the described G. candidum isolates confirmed the potential of these yeasts to produce a wide range of extracellular enzymes. One of the selected G. candidum strains was chosen as a model to set up an immobilized system of viable cells for mill waste bioremediation. Concentration of G. candidum as free cells in the medium, the COD values, the concentration of phenolic compounds, the medium decolourization and the antimicrobial activity were measured at estabished interval times for both immobilized and free G. candidum biomasses. Indeed, the COD removal and phenolics degradation by calcium alginate entrapped cells were higher than those of free cells, because the immobilization dramatically reduces the extracellular protease(s) activity, thus increasing the stability of microbial secreted oxidases.L’avvento delle biotecnologie ha consentito di produrre grandi quantitativi di enzimi ad elevati livelli di purezza da utilizzare in diversi processi industriali. Questa potenzialità ha permesso di aumentare l’efficienza delle reazioni, ridurre i costi di produzione ed i prodotti reflui di lavorazione. Le ossidasi, in particolare laccasi e tirosinasi, sono enzimi ubiquitari che trovano applicazioni biotecnologiche in ambito biomedico, farmaceutico, cosmetico, industriale ed ambientale. Scopo di questo progetto di ricerca è l’isolamento, la caratterizzazione funzionale di laccasi e tirosinasi di origine fungina, l’espressione di tali proteine in forma ricombinante e lo sviluppo di loro potenziali applicazioni in ambito biotecnologico ed industriale. Per quanto riguarda le laccasi da basidiomiceti, il gene ERY3 codificante un’isoforma di laccasi, è stato isolato dal fungo basidiomicete Pleurotus eryngii, ed è stato espresso in forma eterologa e funzionalmente attiva nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Inoltre, è stata ottimizzata una procedura di immobilizzazione delle cellule di lievito ricombinanti in sferette di calcio alginato. Il gene ERY4 di P. eryngii, codificante una laccasi, è stato espresso in forma ricombinante in S. cerevisiae, ma la proteina prodotta si è dimostrata non biologicamente attiva. Il gene ERY4 è stato sottoposto ad un’analisi mutazionale secondo i tre seguenti approcci: i) delezione progressiva della parte C-terminale della proteina codificata, ii) mutagenesi puntiforme della medesima regione, iii) sostituzione nelle porzioni N e C terminale della laccasi Ery4 con le equivalenti regioni dell’isoforma Ery3. I geni ricombinanti sono stati espressi in S. cerevisiae. Le laccasi ricombinanti prodotte hanno mostrato di possedere, nella quasi totalità, attività enzimatica e peculiari affinità per una serie di differenti substrati. Due delle isoforme mutanti prodotte sono state immobilizzate sulla superficie esterna delle cellule di lievito mediante fusione con proteine endogene di parete. Le proteine immobilizzate sono state caratterizzate da un punto di vista biochimico e visualizzate correttamente sulla superficie esterna delle cellule ricombinanti di lievito. La tirosinasi Ppo2 di Agaricus bisporus è stata prodotta nel lievito S. cerevisiae, purificata mediante cromatografia di affinità e caratterizzata biochimicamente. Secondo quanto riportato in letteratura, questa è la prima espressione di una tirosinasi di origine fungina nel lievito S. cerevisae in forma biologicamente attiva. 4 Allo scopo di isolare microorganismi produttori di ossido reduttasi da nicchie ecologiche di interese biotecnologico, sono stati prelevati dei campioni di acque reflue di lavorazione (OMW) da cinque differenti oleifici del Salento (Puglia). E’ stata isolata la popolazione microbica (lieviti e muffe) e un campione della stessa è stato identificato molecolarmente. I lieviti sono stati selezionati sulla base della loro capacità di usare le OMW come unica fonte di nutrimento. Un ceppo di Geotricum candidum, utilizzato per fermentare un campione di OMW, ha mostrato la capacità di ridurre significativamente la concentrazione dei composti fenolici e l’attività antimicrobica dello stesso. Il ceppo di G. candidum è stato utilizzato per la messa a punto di un sistema di immobilizzazione di cellule vive per la riduzione dell’impatto ambientale dei reflui oleari. La rimozione della COD e la degradazione dei fenoli risulta più elevata per le cellule immobilizzate rispetto alle stesse in forma libera, perché l’immobilizzazione riduce notevolmente la presenza di proteasi extracellulari, aumentando così la stabilità delle ossidasi microbiche.Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetal