NMR investigation of ion-pair modulation of protein structure and dynamics and their relation to protein stability

Salt ions differ in their ability to salt out or salt in proteins from aqueous solutions. Their effects on protein stability are known to be connected to ion hydration, ion pairing and ion-specific interactions with the protein. In general, cations follow the Hofmeister series for protein stabilisation behaviour, while for anions this is only true for proteins where the backbone effect is stronger than that of the positively charged side chains. Since at low concentrations electrostatic effects are expected to be the most significant, ion-specific effects become dominant at high salt concentrations. However, the molecular details of how ions interact with proteins have not yet been fully understood. In this thesis, using different nuclear magnetic resonance (NMR) methodologies and ionic liquids (ILs) as models for the investigation of salt and/or ion-pair effects on protein stability, I prove that molecular mechanisms which result in protein stabilisation or destabilisation are opposed (in enthalpic and entropic terms). These mechanisms depend not only on physical and chemical nature of ions but also on the protein properties. The variety of combinations to form ILs allowed the investigation of the effects of choline glutamate ([Ch][Glu], stabiliser) or 1-butyl-3-methylimidazolium dicyanamide ([Bmim][dca], denaturant) on two model proteins with distinct stability and structural properties: GB1 (DGF→U ~ 7 kcal/mol) and drkN SH3 (DGF→U ~ 0 kcal/mol). The possibility of ion-specific interactions with the protein was studied and the changes of protein structure, diffusion, dynamics, and solvent exchange in the presence of IL were characterized. The data gathered for GB1 and drkN SH3 revealed that [Ch][Glu] at high concentrations (> 1 M) stabilises proteins, not only via electrostatic contacts, but also through a preferential accumulation mechanism at the protein surface, in agreement with an entropicdriven mechanism due to excluded-volume effects. At low IL concentrations, a preferential hydration of the protein is not entirely excluded, which could lead to an initial protein destabilisation. On the other hand, [Bmim][dca] denatures proteins by preferential and direct but unfavourable hydrophobic interactions. These interactions occur not only with the core of the folded state, but also with the unfolded state (slowing the folding process). This was revealed by structural and thermodynamic studies with drkN SH3 where it was possible to directly evaluate the perturbations on the unfolded state due to the slow exchange between the two states. This interaction leads to a stabilisation of a residual helical structure in the unfolded ensemble, which contradicts the random coil-like structure typically found in the presence of denaturing agents. The data gathered provided a thorough understanding of ILprotein interactions as well as the mechanism by which they can affect protein’s equilibrium thermodynamics and kinetics, illustrating the importance of the unfolded state and a possible impact in the rational design of solvents in biotechnological processes, for example, increasing not only the catalytic activity but also the enzyme thermostability in such media.Os sais diferem na sua capacidade de promover a precipitação ou a solubilização de proteínas em soluções aquosas. Os seus efeitos na estabilidade das proteínas são normalmente descritos tomando em consideração a hidratação dos iões, a força do par iónico e as interações especificas do catião/anião com a proteína. Em geral, em termos de efeito sobre a estabilidade de proteínas, os catiões seguem a série de Hofmeister, enquanto que para os aniões a ordem de estabilidade de Hofmeister é apenas seguida se os efeitos sobre a cadeia principal da proteína forem superiores àqueles com as cadeias laterais carregadas positivamente. Uma vez que a baixas concentrações prevalecem os contactos electroestáticos inespecíficos, que podem destabilizar a proteína, os efeitos específicos dos iões são dominantes a altas concentrações. Apesar de toda a literatura existente, o mecanismo de ação dos iões sobre a estabilidade das proteínas não está totalmente elucidado ao nível molecular. Nesta tese, utilizando diferentes metodologias de ressonância magnética nuclear (RMN) e líquidos iónicos (LIs), como modelos para a investigação de efeitos de sais e/ou pares iónicos sobre a estabilidade e estrutura de proteínas, eu demonstro que os mecanismos moleculares dependem não só das propriedades físicas e químicas dos iões, mas também da proteína. A versatilidade de combinações possíveis para formar LIs permitiu investigar os efeitos do glutamato de colina ([Ch][Glu], estabilizador) e do dicianamida de 1-butil-3-metilimidazólio ([Bmim][dca], desnaturante) em proteínas-modelo com estabilidade e estrutura muito distintas: GB1 (DGF→U ~ 7 kcal/mol) e drkN SH3 (DGF→U ~ 0 kcal/mol). Entre outros aspetos, foram estudadas a ocorrência de interações especificas ião/proteína e foram caracterizadas as alterações estruturais, difusionais, de permuta e de dinâmica das proteínas na presença dos LIs. Os dados recolhidos para a GB1 e a drkN SH3 indicam que a concentrações altas o [Ch][Glu] (> 1 M) estabiliza as proteínas modelo não apenas por contactos electroestáticos, mas também por acumulação preferencial na superfície da proteína, de acordo com um mecanismo geral entrópico por efeito de volume excluído. Para concentrações baixas deste LI, a hidratação preferencial da proteína não é totalmente excluída, o que poderá levar a uma desestabilização da proteína. Em contraste, o [Bmim][dca] desestabiliza fortemente as proteínas através de interações preferenciais, diretas e hidrofóbicas. Estas interações ocorrem não apenas com o núcleo do estado enrolado mas também com estados da população sem enrolamento. Utilizando a drkN SH3, devido à permuta lenta entre os dois estados na escala de tempo do desvio químico em RMN, foi possível avaliar diretamente as perturbações dos estados enrolado e sem enrolamento. Para o estado sem enrolamento, esta interação leva à estabilização de uma estrutura residual de hélice, o que contradiz a estrutura de enrolamento aleatório (random coil) normalmente observada na presença de agentes desnaturantes. Os resultados desta tese ilustram uma metodologia que permite uma compreensão detalhada, a nível molecular, das interações proteína-líquido iónico, bem como do mecanismo através do qual é afetada a termodinâmica e cinéticas do equilíbrio entre estados enrolado e sem enrolamento. Trata-se de uma contribuição importante para o desenho e otimização racional de solventes para utilização em processos biotecnológicos, como por exemplo, para o aumento da termoestabilidade e da atividade catalítica de enzimas