Interplay between molecular and cellular players on glioma pathophysiology

Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeMalignant gliomas are the most common primary brain tumors, accounting for 80% of all neoplasms of the central nervous system, of which glioblastoma (GBM) is the most aggressive and deadly subtype. Even with a multimodal therapy approach that includes surgery and chemo-radio-therapy, the prognosis of glioma patients remains very poor. Moreover, the etiology and clinically-relevant prognostic factors in glioma remain largely undetermined. In this context, the research summarized in this thesis focuses on i) evaluating the influence of TGF-β1 genetic variants in glioma susceptibility and patient prognosis; ii) identifying novel defining characteristics of glioma stem cells (GSCs), a subpopulation of cells that plays critical roles on tumor initiation, resistance and recurrence; and iii) unveiling new insights on the influence of mesenchymal stem cells (MSCs) in glioma behavior. Many genetic polymorphisms have been associated with glioma susceptibility and prognosis. Several studies demonstrated that polymorphisms in the TGF-β1 gene were associated with the susceptibility for different tumor types. Transforming growth factor beta (TGF-β) is known to play an important role in carcinogenesis, and its activity has been associated with poor prognosis in glioma patients. Taking into account that the relevance of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in TGF-β1 in glioma is not known, we evaluated two SNPs (-509C/T and 869T/C) in this gene in glioma risk and patient prognosis. A case-control study involving 138 Caucasian cancer-free control and 118 glioma patients from Portugal was performed. We showed that TGF-β1 -509C/T and 869T/C variants were not significantly associated with glioma risk. Importantly, we demonstrated that both homozygous -509TT and 869CC genotypes were associated with longer overall survival of GBM patients. Our data suggested that TGF-β1 -509C/T and 869T/C polymorphisms may be relevant prognostic biomarkers in GBM patients. A striking characteristic of malignant gliomas, particularly GBMs, is their highly heterogeneous and therapy-resistant nature. These features are partly attributed to GSCs, a subpopulation of cancer cells with stem cell features that are involved in tumor initiation, progression, and recurrence, making them crucial therapeutic targets. Their isolation has been challenging as the markers typically used lack sufficient specificity and sensitivity. Thus, we also investigated here if intracellular autofluorescence, a biomarker of epithelial cancer stem cells, could be used as a biomarker to improve GSCs identification and isolation. We found that both established and patient-derived primary GBM cells presented a subpopulation of autofluorescent cells (Fluo+). Moreover, we showed that Fluo+ cells had typical features of GSCs, including higher expression of stem cell protein markers and pluripotency-associated genes, enriched capacity to grow as neurospheres, and long-term self-renewal ability. Additionally, treatments with temozolomide (TMZ) or radiation led to a significant increase in the percentage of Fluo+ cells. Importantly, in vivo studies showed that mice with intracranial tumors derived from Fluo+ GBM cells presented a significantly shorter overall survival than those with non-autofluorescent cells (Fluo-) GBM cells. Finally, the underlying mechanism of the autofluorescent phenotype was due to the uptake, and accumulation of riboflavin in GSCs, by the ABCG2 transporters, exclusively in cells with GSCs’ features. Together, our data revealed autofluorescence as a novel and useful biomarker for GSCs. In the light of the lack of curative therapies for malignant glioma, many exploratory therapeutic strategies have been analyzed. Among these, MSCs have been studied as a new approach for the treatment of malignant gliomas, due to their inherent capacity of homing to glioma, and their ability to be engineered to deliver anti-tumoral agents. In the third experimental work included in this thesis, we assessed the impact of the secretome of MSCs on hallmark characteristics of GBM cells, such as cell viability, migration, proliferation, tumor growth, as well as chemotherapy response. Using in vitro approaches, we observed that GBM cells exposed to conditioned media (CM) from human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs, a MSC population) presented an increased cellular viability, proliferation and migration, while not affecting the sensitivity of GBM cells to TMZ treatment. Additionally, in the in vivo CAM assay, we found that CM from HUCPVCs promoted GBM tumor growth. Finally, proteomic analyses to characterize the secretome of HUCPVCs identified several proteins involved in promotion of cell survival, proliferation and migration, revealing novel putative molecular mediators for the effects observed in GBM cells exposed to HUCPVCs CM. Our data highlights that caution must be taken regarding the use of MSCs as stem-cell based therapies for GBM. In summary, the thesis presented here contributes to the better understanding of several dimensions of glioma, from factors that may be causative, to those that influence their pathophysiology and progression, to therapeutics insights. Particularly, assessing TGF-β1 SNPs -509C/T and 869T/C variants may be clinically relevant for GBM patients; using autofluorescence as a biomarker for GSCs identification may be important to develop new GSCs-specific therapies; and using MSCs as stem cell-based therapies for GBM does not seem to be a safe choice.Os gliomas malignos são os tumores primários do cérebro mais frequentes, constituindo cerca de 80% de todas as neoplasias do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma (GBM) o subtipo mais agressivo e letal. Mesmo com as abordagens terapêuticas usadas, que incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, o prognóstico de doentes com glioma continua bastante crítico. Além disso, a etiologia e factores clínicos de prognóstico relevantes dos gliomas são praticamente desconhecidos. Neste contexto, os estudos sumarizados nesta tese pretenderam: i) avaliar a influência das variantes genéticas do gene TGF-β1 na susceptibilidade para glioma e no prognóstico dos pacientes com glioma; ii) identificar novas características das células estaminais de glioma (GSCs), uma subpopulação de células com um papel importante na iniciação, resistência e recorrência dos tumores; e iii) revelar novos conhecimentos que a influência das células estaminais mesenquimatosas (MSCs) têm no comportamento dos GBMs. Muitos polimorfismos genéticos têm sido associados com susceptibilidade para glioma e com prognóstico de pacientes com glioma. Vários estudos demonstraram que polimorfismos do gene TGF-β1 estavam associados com a susceptibilidade para vários tipos tumorais. O transforming growth factor beta (TGF-β) tem um papel importante na carcinogénese e a sua atividade foi associada a um pior prognóstico de pacientes com glioma. Tendo em conta que a relevância de polimorfismos do tipo single nucleotide polymorphism (SNPs) do TGF-β1 em gliomas não é conhecida, nós avaliamos a possível associação de dois SNPs neste gene (- 509C/T e 869T/C) no risco e prognóstico de gliomas. Num estudo de caso-controlo demonstrámos que apesar de nenhum destes polimorfismos do TGF-β1 estar associado com um maior risco de desenvolvimento de glioma, ambos os genótipos homozigóticos -509TT e 869CC estavam associados a uma maior sobrevida de pacientes com GBM. Os nossos resultados sugerem que os polimorfismos -509C/T e 869T/C do TGF-β1 podem ser considerados biomarcadores de prognóstico em pacientes com GBM. Uma característica impressionante dos gliomas, em particular dos GBMs, é a sua elevada heterogeneidade e resistência à terapia. Estas características são, em parte, atribuídas à presença de GSCs, que estão envolvidas na iniciação, progressão e recorrência tumoral, tornando-as um importante alvo terapêutico. O isolamento das GSCs tem constituído um desafio uma vez que os marcadores tipicamente usados não são específicos. Assim, nós também investigámos se a autofluorescência, um marcador usado na identificação de células estaminais cancerígenas de tumores epiteliais, poderia ser usado como novo biomarcador para melhor identificar e isolar as GSCs. Os nossos resultados demonstraram que linhas primárias e estabelecidas de GBM continham células autofluorescentes (Fluo+). Mais ainda, verificámos que as células Fluo+ apresentavam características típicas de GSCs, tais como uma elevada expressão de marcadores de células estaminais e de genes de pluripotencia, maior capacidade para crescer em neuro-esferas e uma capacidade de auto-renovação mais prolongada. Após tratamento com temozolomida (TMZ) e radiação verificou-se um aumento da percentagem de células Fluo+. Para além disso, estudos in vivos revelaram que murganhos injetados intracranialmente com células de GBM Fluo+ apresentavam uma sobrevida significativamente menor do que murganhos injetados com células de GBM Fluo-. Por fim verificámos que o mecanismo subjacente ao fenótipo da autofluorescência era exclusivo das GSCs e se devia ao transporte de riboflavina, pelos transportadores ABCG2, e à sua acumulação intracelular. Todas estas evidências revelaram claramente que a autofluorescência é um novo biomarcador para a identificação de GSCs. Tendo em conta a falta de terapias curativas no tratamento de glioma, muitas estratégias terapêuticas exploratórias têm sido analisadas. Entre estas, as MSCs têm sido estudadas como uma nova abordagem terapêutica no tratamento dos gliomas, uma vez que são capazes de migrar para os gliomas e podem ser facilmente modificadas para distribuir agentes antitumorais. No terceiro trabalho apresentado nesta tese, avaliámos o impacto do secretoma das MSCs em características de agressividade das células de GBM. Estudos in vitro demonstraram que células de GBM expostas a meios condicionados (CM) provenientes de células perivasculares humanas do cordão umbilical (HUCPVCs, uma população de MSCs) apresentavam um aumento na viabilidade, proliferação e migração celulares. Por outro lado, nenhum efeito foi observado na resposta à TMZ. Mais ainda, no ensaio in vivo da CAM, verificámos que o CM das HUCPVCs promovia o crescimento tumoral. Finalmente, a caracterização do secretoma das HUCPVCs foi efectuada por análises de proteómica, o que permitiu identificar varias proteínas envolvidas na sobrevivência, proliferação e migração das células de GBM, revelando novos e putativos mediadores moleculares envolvidos no efeito observado nas células de GBM quando expostas ao CM das HUCPVCs. Os nossos resultados demonstraram que é necessária alguma precaução no uso de MSCs como potenciais agentes terapêuticos para o tratamento de GBM. Em suma, a tese aqui apresentada contribui para uma melhor compreensão de várias dimensões dos gliomas, desde fatores que possam ser causadores da doença, passando por fatores que influenciam a sua patofisiologia e progressão, até a perspetivas terapêuticas. Particularmente, avaliar os níveis dos SNPs -509C/T and 869T/C do TGF-β1 pode ser clinicamente relevante para pacientes com GBM; usar a autofluorescência como biomarcador para identificar e isolar as GSCs poderá ser importante para desenvolver terapias específicas anti-GSCs; e usar MSCs como uma nova abordagem terapêutica no tratamento dos GBMs não aparenta ser uma escolha segura.The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), Minho University. Financial support was provided by grants from the FCT (SFRH/BD/88121/2012); Fundação Calouste Gulbenkian; Liga Portuguesa Contra o Cancro; co-financed by ON.2—O Novo Norte; QREN; FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology under the project POCI-01-0145-FEDER-007038; and the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF