Desenvolvimento de sistemas avançados de cultura celular/tecidular, com base em estruturas de suporte melhoradas e bioreactores sofisticados, para aplicações de engenharia de tecidos

Programa Doutoral em Engenharia BiomédicaIn a typical tissue engineering approach, cells are collected from the patient and then seeded into a threedimensional scaffold where they proliferate to generate a tissue-like substitute to be re-implanted back into the defect site. However, human tissues possess various degrees of complexity which often makes them impossible to be reproduced in such a simplified way. In fact, many tissues such as bone, for example, exhibit specific architectures and shapes, mechanical properties and cellular content that are very challenging to reproduce, in particular when combined together into a single construct. In order to overcome the limitations found in the generation of complex tissues such as bone and bone interfaces with other tissues, various automated technologies have been adopted by tissue engineering approaches to help generate viable tissue substitutes in a time- and cost-effective way. Bioreactors are automated systems where cell-seeded scaffolds can be cultured under highly controlled conditions to generate replacement tissues. They improve the mobility of nutrients and avoid cell death in internal regions of constructs and influence cellular development through biomechanical stimuli. Bioreactors show the potential to generate constructs in a more standardized, traceable, cost-effective, safe and regulatory-compliant way. Additive manufacturing is another highly automated technology which has more recently been introduced into tissue engineering. Its main use has been in producing 3D scaffolds with highly defined architectures by layer-by-layer deposition of materials. Herein we proposed the utilization of additive manufacturing to build simultaneously and concomitantly a 3D scaffold and bioreactor chamber, from different materials, as a single object. This would allow to produce scaffolds readily contained into bioreactor chambers, reducing the necessity for assembling, hence reducing production time and cost as well as the contamination risk due to the significantly decreased manipulation of both the scaffold and bioreactor. In a first approach we aimed at applying this concept to the generation of tailor-made constructs for defectand patient-specific applications. By resorting to medical imaging, a 3D model of a tibia bone tissue section was obtained and utilized as a template for generating a porous tissue replica scaffold as well as an enclosing culture chamber tightly fitting the outer shape of the porous scaffolds. The device showed to be able to homogenously distribute cells throughout the scaffold and to keep them viable along a 6 weeks culture period. In a second approach, the same concept was used to simultaneouslly seed and culture multiple scaffolds contained into one single upscalable perfusion culture device. Additionally, the device was used for coating the scaffolds contained in its interior with a calcium phosphate layer in order to enhance their osteoinductivity upon implantation. Cultured scaffolds showed homogeneous cell distribution and high cell viability throughout a 4 weeks culture period and calcium phosphate-coated scaffolds resulted in a significant increase in cell number. Such device may also find applications in the high throughput screening of combinations of multiple variable factors such as the selected biomaterials, scaffold architectures, cell types and culture regimes. Furthermore, this device might be applicable in the simultaneous generation of large amounts of tissue substitutes in a scenario of widespread adoption of tissue engineering-based therapies. Additive manufacturing was also applied to a specific tissue engineering application that requires the development of a biphasic construct, targeting the generation of bone-periodontal ligament-teeth interfaces in a guided tissue regeneration strategy. In this case additive manufacturing was combined with the electrospinning technology to fabricate the biphasic construct, that is potentially able to accommodate a bone and a periodontal ligament tissue construct in separate cavities. The additively manufactured 3D scaffold was treated by means of a calcium phosphate coating in order to increase its osteoinductivity and then attached to a fine electrospun fibrilar mesh. First the additively manufactured part of the scaffold was seeded with osteoblasts and later the electrospun part was used for depositing cell sheets of periodontal ligament acting as a biomechanical support. After further culture, the complex constructs were finally attached to dentin blocks simulating the surface of teeth and subcutaneously implanted into rats. After 8 weeks of implantation, increased bone formation was observed when comparing to non-coated scaffolds. Histological analysis revealed that the large pore size of the periodontal compartment permitted the vascularization of the periodontal cell sheets and the formation of a tissue similar to native periodontal ligament tissue at the interface with dentin. Given the promising results achieved, this new and complex biphasic scaffold represents therefore a new hope in the regeneration of complex tissue defects resulting from serious forms of periodontitis. Finally, a study was performed to evaluate the feasibility of cryopreservation-based storage and later off-theshelf utilization of cell/scaffold constructs showing that cell and scaffold properties can be maintained upon cryopreservation and that the architecture of porous scaffolds may favor the retention and viability of construct’s cellular content. In summary, the work performed in this thesis resulted in significant advances towards automation and mass production of tailor-made and off-the-shelf tissue engineered products that might facilitate the widespread clinical adoption of tissue engineering strategies holding the promise to revolutionize the treatment of damaged tissues.Numa típica abordagem de engenharia de tecidos, são recolhidas células de um paciente e utilizadas para colonizar um suporte tridimensional poroso onde proliferam e geram um substituto tecidular a ser reimplantado no local danificado. No entanto, a maior parte dos tecidos humanos possui variados graus de complexidade que impossibilitam a sua reprodução de um modo tão simplificado. Muitos tecidos, tais como o osso, exibem arquitecturas e formas, propriedades mecânicas e conteúdos celulares difíceis de reproduzir, particularmente quando combinados num único substituto tecidular. De modo a superar as limitações encontradas na geração de tecidos complexos, tais como o osso e suas interfaces com outros tecidos, várias tecnologias automatizadas têm sido adoptadas em estratégias de engenharia de tecidos de modo a gerar tecidos viáveis de um modo eficiente em termos de tempos e custos de produção. Bioreactores são sistemas automatizados onde estruturas de suporte celularizadas podem ser cultivadas sob condições muito controladas de modo a originarem substitutos tecidulares. Melhoram também a difusão de nutrientes reduzindo a morte celular nas regiões internas dos substitutos tecidulares e influenciam o desenvolvimento celular por aplicação de estimulação biomecânica. Os bioreactores têm potencial para gerar substitutos tecidulares de modo standardizado, rastreável, rentável e seguro, de acordo com as normas aplicáveis. A fabricação aditiva é outra tecnologia altamente automatizada que foi recentemente introduzida na engenharia de tecidos, principalmente na produção de suportes celulares 3D com arquitecturas altamente definidas por deposição de materiais camada-sobre-camada. Nesta tese, propôs-se portanto a utilização de fabricação aditiva para construir simultânea e concomitantemente uma estrutura de suporte celular 3D e uma câmara de bioreactor, a partir de materiais diferentes, como um objecto único. Isto permitiria produzir estruturas de suporte contidas em câmaras de bioreactor reduzindo a necessidade de montagem, o tempo e custo de produção e o risco de contaminação decorrente da manipulação. Numa primeira abordagem o objectivo principal consistiu na aplicação deste conceito à geração de substitutos tecidulares personalizados de acordo com defeitos variáveis em pacientes. Um modelo 3D de uma secção de tibia foi obtido por imagiologia médica e utilizado para gerar um suporte celular poroso replicando a estrutura do osso assim como uma câmara de cultura ajustada à forma exterior do suporte celular. O dispositivo foi capaz de distribuir células homogeneamente pelo suporte celular continuando viáveis durante 6 semanas. Numa segunda abordagem, o mesmo conceito foi utilizado para colonizar e cultivar simultâneamente multiplos suportes celulares contidos num único dispositivo expansível de cultura de perfusão. Adicionalmente, o dispositivo foi usado para recobrir as estruturas de suporte celular com uma camada de fosfato de cálcio de modo a aumentar a sua osteoindutividade após implantação. Tal dispositivo pode ser aplicável na triagem de alta produtividade envolvendo multiplas variáveis tais como o biomaterial, arquitectura do suporte celular, tipos celulares e regimes de cultura utilizados. Este dispositivo pode também ser aplicável na geração simultânea de grandes quantidades de substitutos tecidulares num cenário de adopção generalizada de terapias de engenharia de tecidos. Os suportes celulares cultivados revelaram distribuição celular homogénea, alta viabilidade celular e um significativo aumento do conteúdo celular durante 4 semanas particularmente quando revestidos com fosfato de cálcio. A fabricação aditiva foi também aplicada especificamente na geração de interfaces osso-ligamento periodontal-dente por meio de um substituto tecidular bifásico desenvolvido numa estratégia de regeneração tecidular guiada. Neste caso, a fabricação aditiva foi combinada com tecnologia de electrospinning para fabricar um substituto tecidular bifásico potencialmente capaz de acomodar substitutos ósseos e periodontais em cavidades separadas. O suporte celular 3D fabricado aditivamente foi recoberto com fosfato de cálcio para aumentar a sua osteoindutividade e ligado a uma fina malha fibrilar produzida por electrospinning. Primeiramente, a parte fabricada aditivamente foi colonizada com osteoblastos e mais tarde na malha produzida por electrospinning foram depositadas camadas celulares de ligamento periodontal actuando como um suporte biomecânico. Após cultura, os complexos substitutos tecidulares foram justapostos a blocos de dentina simulando a superfície dentária e implantados subcutâneamente em ratos. Após 8 semanas de implantação, uma acentuada formação de osso foi observada quando comparando com suportes celulares não recobertos. Análises histológicas revelaram também que os largos poros do compartimento periodontal permitiram a vascularização das camadas celulares periodontais e a formação de tecido semelhante ao ligamento periodontal nativo no interface com a dentina. Tendo em conta os bons resultados obtidos, este novo e complexo scaffold bifásico representa assim uma nova esperança na regeneração de defeitos em casos extremos de periodontite. Finalmente, foi feito um estudo para avaliar a exequibilidade do armazenamento por criopreservação e posterior utilização de estruturas de suporte com células demonstrando que as propriedades das células e scaffolds podem ser mantidas após criopreservação e que a arquitectura de estruturas porosas podem favorecer a retenção do conteúdo celular e sua viabilidade. Em resumo, o trabalho desenvolvido no âmbito desta tese resultou em avanços significativos no sentido de automatizar a produção em massa por engenharia de tecidos de produtos customizados prontos a usar e assim facilitar a aplicação clínica generalizada de estratégias de engenharia de tecidos que prometem revolucionar o tratamento de tecidos danificados.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for my PhD grant SFRH/BD/62452/2009, the North Portugal Regional Operational Programme (ON.2 – O Novo Norte), under the National Strategic Reference Framework (NSRF), through the European Regional Development Fund (ERDF) and the HIPPOCRATES (NMP3-CT-2003-505758), DISC REGENERATION (NMP3-LA-2008-213904) and MARIE CURIE ALEA JACTA EST (MEST-CT-2004-008104) european projects for funding