The gluN2B subunit of NMDARs and its role in glutamatergic synapses : towards the characterization of the proteome of postsynaptic densities from wild-type and GluN2B-null cultured neurons

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) are unique regulators of glutamatergic synaptic transmission in the central nervous system (CNS). These ionotropic glutamate receptors play a crucial role in shaping the strength of synaptic connections, which underlies mechanisms of learning and memory formation. The GluN2B subunit of NMDARs is crucial for the organization of postsynaptic macromolecular complexes involved in glutamatergic transmission, and previous results from our group have shown that in the absence of GluN2B there is dramatic reduction of synaptic NMDARs in hippocampal neurons, despite the presence of other GluN2 subunits. To determine the composition of the molecular complexes organized by GluN2B we proposed to evaluate biochemically the postsynaptic densities (PSDs) isolated from cultured cortical neurons of wild-type and GluN2B (-/-) mice, since the PSDs are organized postsynaptic structures specialized for postsynaptic signalling and plasticity, and is at PSDs that receptors, associated signaling molecules and cytoskeleton elements are assembled through scaffold proteins. The study of the PSD is a valuable approach to understand which molecular determinants govern glutamatergic synaptic transmission. PSDs can be purified biochemically from brain tissue through several centrifugation steps, and are therefore amenable to characterization. However, since GluN2B (-/-) mice are not viable, in the present work we developed and validated a protocol for the purification of PSDs from cultured cortical neurons isolated from GluN2B (-/-) embryos and wild-type littermates, and maintained in culture for 15 days, to guarantee synapse maturation. This procedure allows isolating PSDs from 38M cultured neurons and yields, in average, the amount of protein required for biochemical assays (10 to 20μg), namely mass spectrometry analysis. The isolated fractions were fully characterized biochemically, and acomparison between the crude homogenate, synaptosomal and PSD fractions suggests that our method is reliable and efficient in yielding final pure fractions. We found that PSDs isolated from GluN2B (-/-) cultured cortical neurons exhibit a reduction of approximately 50% in protein content, when compared to PSDs isolated from wild-type cultured cortical neurons, suggesting that GluN2B indeed is an indispensable element for the maintenance of postsynaptic macromolecular complexes. Quantitative analysis of the protein content of the isolated PSDs, by iTRAQ-labeling in conjunction with tandem mass liquid chromatography and mass spectrometry, is underway, in collaboration with Dr. Ka Wan Li neuroproteomics group. The characterization of the full proteome of GluN2B (-/-) cultured cortical neuron PSDs will provide new insights regarding the role of GluN2B at the synapse.Os receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs) são reguladores únicos da transmissão sináptica glutamatérgica no sistema nervoso central. Estes receptores ionotrópicos do glutamato desempenham um papel importante na modulação da eficiência das conexões sinápticas, que está na base dos mecanismos de formação de memória e aprendizagem. A subunidade GluN2B dos NMDARs é crucial para a organização dos complexos macromoleculares pós-sinápticos envolvidos na transmissão glutamatérgica, e resultados anteriores do nosso grupo demonstraram que na ausência de GluN2B existe uma redução dramática dos NMDARs sinápticos em neurónios do hipocampo, apesar da presença de outras subunidades GluN2. Para determinar a composição dos complexos moleculares organizados pela subunidade GluN2B nós propusemo-nos a avaliar bioquimicamente as densidades pós-sinápticas (PSDs) isoladas a partir de neurónios de córtex em cultura de murganhos wild-type e GluN2B (-/-), uma vez que a PSD é uma estrutura pós-sináptica organizada e especializada para sinalização e plasticidade, e é o local onde os receptores, associados a moléculas de sinalização e elementos do citoesqueleto, estão organizados, através de proteínas âncora. O estudo da PSD é visto como uma abordagem valiosa para perceber quais os determinantes moleculares que governam a transmissão sináptica glutamatérgica. As PSDs podem ser purificadas bioquimicamente a partir de cérebro usando vários passos de centrifugação e, são por isso, possíveis de caracterizar. No entanto, uma vez que ratinhos GluN2B (-/-) não são viáveis, no presente estudo desenvolvemos e validamos um protocolo para a purificação de PSDs a partir de neurónios de córtex em cultura isolados de embriões GluN2B (-/-) e wild-type, mantidos em cultura durante 15 dias, de modo a garantir a maturação das sinapses. Este procedimento permite isolar PSDs a partir de 38M de neurónios em cultura e permite obter, em média, a quantidade de proteína necessária para ensaios bioquímicos (10 a 20μg), nomeadamente para análise por espectrometria de massa. As fracções isoladas foram totalmente caracterizadas bioquimicamente, e a comparação entre as fracções inicial, sinaptosomal e PSD, sugere que o nosso método é fiável e eficiente para se obter fracções finais puras. Nós descobrimos que as PSDs isoladas a partir de neurónios de córtex em cultura GluN2B (-/-) exibem uma redução de aproximadamente 50% no conteúdo proteico, quando comparado com PSDs isoladas a partir de neurónios de córtex em cultura wild-type, sugerindo que a subunidade GluN2B é um elemento indispensável para a manutenção dos complexos macromoleculares pós-sinápticos. A análise quantitativa do conteúdo proteico das PSDs isoladas, por marcação com reagentes iTRAQ conjuntamente com cromatografia liquida acoplada e espectrometria de massa, está a ser efectuada, em colaboração com o grupo de neuroproteómica do Dr. Ka Wan Li. A caracterização das PSDs isoladas a partir de neurónios de córtex em cultura GluN2B (-/-) proporcionará novas pistas sobre o papel da subunidade GluN2B na sinapse