Modulation of invariant natural killer T (INKT)-Cell function in immune-mediated diseases

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Invariant natural killer T (iNKT) cells are innate-like lymphocytes that respond to glycolipids with rapid cytokine release, including IFN-Ү, IL-4 or IL-17, thus recapitulating many features of T-helper (Th) responses. Furthermore, the host laboratory recently showed that iNKT cells can induce de novo expression of Foxp3 in presence of TGF-β, thereby adopting a regulatory phenotype similar to Treg cells. Specific Th-like cytokine patterns have been associated to distinct iNKT-cell NK1.1/CD4 subsets. We investigated the plasticity of these four subpopulations in response to the same stimuli driving the polarization of conventional CD4 T cells towards a Treg, “Th9” or Th17-like phenotype in vitro. Polarization was achieved within all iNKT-cell subsets, although with different efficiencies. Importantly, NK1.1/CD4 were down-modulated, suggesting their expression probably define functional states rather than fixed lineages. Using an allergic airways disease model where iNKT cells play a pathogenic role, we showed that anti-CD4 monoclonal antibody (MAb) treatment decreased iNKT-cell infiltrates in the airways and modified iNKT-cell phenotype in the draining lymph nodes, which correlated with disease prevention. Our results also show that, in a model of experimental autoimmune encephalomyelitis where a protective role is attributed to iNKT cells, anti-CD4 MAb treatment, as well as α-GalCer (a specific iNKT agonist) administration can prevent the disease. This correlated with increased iNKT-cell content in cervical LNs and spleen compared to sick mice and, more importantly, with higher numbers of Foxp3+ iNKT cells. Collectively, our results reveal that all NK1.1/CD4 iNKT-cell subsets share a similar plasticity in response to environmental stimuli, thus challenging the general assumption that cytokine expression is restricted to certain iNKT subpopulations. Finally, we also show that iNKT cells can be subject to immunomodulation protocols that prevent diseases, which renders this population a new potential target for pharmacological intervention aiming to control immune mediated disorders.As células T “natural killer” invariantes (iNKT) constituem uma população heterogénea de linfócitos capaz de expressar receptores típicos de células NK (como NKG2D e NK1.1 - CD161 em humanos) e de linfócitos T convencionais (como CD3, CD4, CD8 ou TCR αβ). Estas células desenvolvem-se no timo e reconhecem glicolípidos apresentados por CD1d, uma molécula não clássica do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Apesar de representarem uma pequena população dentro do sistema imunitário (menos de 1% no sangue periférico humano), têm sido implicadas na modulação de diferentes patologias, incluindo na asma alérgica e na esclerose múltipla. A sua activação leva à rápida secreção de citocinas características de respostas Th1, Th2, “Th9” ou Th17. Estes tipos de resposta têm sido associados a diferentes linhagens de linfócitos iNKT, identificadas de acordo com a expressão de NK1.1 e do co-receptor CD4: respostas do tipo Th1 têm sido associadas a subpopulações CD4-, respostas do tipo Th2 atribuem-se principalmente a subpopulações CD4+ e, mais recentemente, dois estudos diferentes restringiram a secreção de IL-17 às subpopulações NK1.1-. Para além disso, resultados obtidos no nosso laboratório demonstram que, na presença de TGF-β, é possível induzir um fenótipo T regulador (Treg) associado à expressão do factor de transcrição Foxp3, tanto em células iNKT de ratinho, como humanas. Note-se que todas as células iNKT em que é induzida a expressão de Foxp3 perdem NK1.1 na sua superfície, embora possam expressar ou não o co-receptor CD4. Para avaliar a plasticidade de cada uma das quatro subpopulações NK1.1/CD4 de células iNKT em resposta a diferentes estímulos, estas células foram isoladas de baços de ratinhos C57BL/6, as diferentes subpopulações identificadas com base na expressão de NK1.1 e CD4 e, então, separadas por citometria de fluxo. Após 3 a 5 dias de cultura nas condições usadas para induzir a expresão de Foxp3 ou IL-17 em células T CD4 convencionais, verificou-se que todas as subpopulações NK1.1/CD4 de células iNKT têm a capacidade de induzir a expressão destes genes. A expressão dos mesmos, no entanto, não foi detectável por citometria de fluxo quando as células foram analisadas ex vivo, antes da cultura. Curiosamente, foi detectada nas culturas que conduzem à indução de Foxp3 a expressão de elevados níveis IL-9. Sabe-se que a polarização para um fenótipo do tipo “Th9” é dependente de TGF-βe IL-4. Contudo, esta última citocina não constitui um componente do cocktail de polarização adicionado às culturas de indução de Foxp3. No entanto, as células iNKT são capazes de secretar IL-4 após activação, tendo a sua presença sido detectada por ELISA nos sobrenadantes das culturas. Esta observação sugere que as células iNKT em cultura, ao serem estimuladas secretam IL-4 que, em sinergia com o TGF-βadicionado exogenamente, actua de forma autócrina sobre as células iNKT levando à indução da expressão de IL-9. Esta hipótese foi confirmada num ensaio em que diferentes concentrações de anticorpo neutralizante contra IL-4 foram adicionadas às culturas, o que não afectou a expressão de Foxp3, mas diminuíu de forma significativa a secreção de IL-9. Note-se que, no entanto, as eficiências de polarização para os diferentes fenótipos foram diferentes nas quatro subpopulações de células iNKT. A expressão máxima de Foxp3 foi observada na subpopulação NK1.1-CD4- (41%), sendo as restantes semelhantes entre si (20%). A expressão de IL-9 intracelular, por sua vez, variou entre os 5 e os 15% em todas as subpopulações, parecendo haver uma tendência para uma expressão mais elevada nas subpopulações NK1.1+CD4+ e NK1.1+CD4-. A expressão de IL-17 foi máxima nas subpopulações NK1.1-CD4+ e NK.1+CD4- (aproximadamente 30%) não ultrapassando os 10% nas restantes subpopulações. De notar que as quantidades de IL-17 secretadas por estas subpopulações são cerca de oito vezes superiores às produzidas por células T CD4 convencionais polarizadas nas mesmas condições. Apesar de, no caso da indução de IL-17, os resultados obtidos não serem suficientes para excluir expansão de células IL- 17+ pré-existentes, estes indicam porém que a expressão de IL-17, bem como de IL-9 ou Foxp3, não é restrita a uma subpopulação específica, como previamente sugerido. Em todas as condições e subpopulações de células iNKT houve uma perda da expressão de NK1.1 e/ou CD4 após polarização, o que sugere que estas moléculas não definem linhagens dentro da população de linfócitos iNKT, reflectindo provavelmente um estado funcional. A elevada plasticidade apresentada pelas células iNKT e a capacidade de apresentar um fenótipo regulador sugere a utilidade da sua manipulação para fins terapêuticos. Para testar esta hipótese, tiramos partido de dois modelos animais de resposta do tipo Th2 (asma alérgica) ou Th17 (esclerose múltipla), nos quais se sugere, respectivamente, um papel de agravamento ou protecção da doença por parte das células iNKT. Estudos efectuados pelo nosso grupo demonstraram que em ambas as patologias é possível reprogramar o sistema imunitário de modo a induzir tolerância através da administração de um anticorpo monoclonal anti-CD4 não depletante. Uma vez que as células iNKT podem expressar este co-receptor, colocámos a hipótese de que o estado de tolerância induzido pela administração do anticorpo pode dever-se também a alterações induzidas nesta população, reflectindo-se numa alteração nos números, fenótipo ou função das células iNKT. No modelo de asma alérgica induzida mediante a administração intra-nasal de ovalbumina, o grupo experimental de ratinhos em que a doença foi prevenida com o anticorpo anti-CD4 apresentou uma diminuição nos infiltrados de células iNKT nos lavados bronco-alveolares e nos pulmões, mas não nos gânglios linfáticos do mediastino. Apesar de os números de células iNKT nos gânglios drenantes não serem significativamente alterados, observámos alterações no seu fenótipo: a expressão de CD62L, CD103, e CD4 foi diminuída. Assim, para investigar se as mesmas alterações ocorrem na presença de um alergéneo mais fisiológico, a patologia foi induzida com ácaros. O mesmo protocolo de tolerância com anti-CD4 revelou-se capaz de prevenir a doença, levando a uma diminuição da infiltração de células iNKT nas vias aéreas. No modelo de esclerose múltipla, observámos que os números de células iNKT no baço e gânglios linfáticos cervicais de ratinhos doentes eram inferiores aos do grupo controlo saudável, sendo a maioria destas células CD4-. O tratamento com o anticorpo monoclonal anti-CD4 teve um elevado sucesso na prevenção das manifestações clínicas da doença, impedindo a infiltração linfocitária do sistema nervoso central elevando a um aumento das células iNKT nos gânglios linfáticos cervicais e no baço, atingindo níveis semelhantes aos dos controlos saudáveis. De salientar que, neste modelo, detectámos pela primeira vez a expressão de Foxp3 nas células iNKT in vivo, estando o número destas células aumentado em animais que receberam o tratamento com o anticorpo. Em conclusão, os resultados obtidos nos modelos de asma alérgica e esclerose múltipla sugerem que o tratamento com anticorpo monoclonal específico do coreceptor CD4 tem também impacto na população de células iNKT. Ainda que a acção deste anticorpo possa ser directa, dado que muitas células iNKT expressam CD4, não é possível excluir a possibilidade de que a acção seja indirecta, através linfócitos T CD4 convencionais. Considera-se que a activação de células iNKT no modelo de esclerose múltipla contribui para a prevenção dos sintomas, estando associada à inibição da proliferação de células T convencionais agressivas do tipo Th17. Contudo, a relação desta protecção com um fenótipo regulador associado à expressão de Foxp3 nunca tinha sido investigada. Para testar esta hipótese, num grupo experimental de ratinhos em que a doença foi induzida, procedeu-se à activação in vivo das células iNKT com o ligando específico α-GalCer, em paralelo com a imunização. O estado de tolerância induzido por este protocolo foi semelhante ao induzido pelo anticorpo monoclonal anti- CD4, levando não só ao aumento do número de células iNKT nos gânglios linfáticos drenantes e no baço, mas principalmente a um aumento de células iNKT reguladoras que expressam Foxp3. Estudos adicionais são necessários para compreender os mecanismos subjacentes a este fenómeno. A capacidade das células iNKT de mimetizar diferentes subtipos de células T CD4, nomeadamente a capacidade de adquirir um fenótipo regulador, associada à rápida e elevada produção de factores solúveis, sugere a possibilidade de utilização de terapias dirigidas a esta população de linfócitos. Observámos que é possível expandir estas células em resposta a α-GalCer, o que sugere que é possível a sua utilização em terapias autólogas. A compreensão do grau de implicação das células iNKT em diferentes patologias humanas é importante para seleccionar as melhores abordagens de intervenção terapêutica. Em suma, os nossos estudos sugerem que a população iNKT pode ser um alvo promissor de imunoterapia