Deletion of sdaB reduces the susceptibility to vancomycin in Clostridioides difficile

Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe intense and often inappropriate use and disposal of antibiotics have led to a world-wide rise in the pervasiveness of antibiotic-resistant bacteria, thereby strongly impairing our ability to treat bacterial infections in both humans and animals. Clostridioides difficile is a major nosocomial pathogen and the leading cause of a range of intestinal conditions linked to antibiotic therapy. Antibiotic treatment causes dysbiosis and allows ingested spores of C. difficile to germinate and the resulting cells to grow into a population that produces the two main virulence factors of this organism, the TcdA and TcdB toxins. C. difficile strains that are resistant to multiple antibiotics are at an advantage and have been responsible for a rise in the number of out-breaks associated with higher morbidity and mortality caused by this organism. An important antibiotic used to treat infections by C. difficile is the glycopeptide vancomycin. The lethal target of vancomycin (VAN) is the D-Ala-D-Ala motifs in lipid II. Resistance often depends on the expression of van clusters which allow remodelling of the dipeptide termini of peptidoglycan (PG) precursors from D-Ala-D-Ala to D-Ala-D-Lac or D-Ala-D-Ser, with reduced affin ity for VAN. Other mechanisms of resistance are less understood. Susceptibility to VAN in C. difficile is intriguing because moststrains carry a functional vanG type cluster. However, disruption of the vanGCd cluster in C. difficile, lowers only slightly the MICVAN. One strain with reduced susceptibility to VAN bears three mutations, including the sdaB gene, coding for a putative L-Serine deaminase that converts L-Ser into pyruvate. In this study, we focused on the role of the sdaB. We found that sdaB is not under sporulation control and does not respond to the branched chain amino acids that are sensed by the global regulatory protein CodY. Deletion of sdaB decreases the susceptibility of C. difficile to VAN, suggesting that the mutation favours the channelling of L-Ser into the PG biosynthetic pathway. In line with this prediction, the mutant shows reduced labelling of living cells with a fluorescent derivative of VAN, which binds to D-Ala-D-Ala motifs. Deletion of sdaB also increases biofilm formation, possibly because the mutation reduces the intracellular level of pyruvate and stimulates its uptake from the extracellular medium. We purified SdaB under anaerobic conditions and we have shown that its UV/VIS absorption spectrum is consistent with that of an [4Fe-4S] cluster protein. In conclusion, the availability of L-Sermay be a bottleneck in the expression of VAN resistance even when VAN induces the vanGCd operon. Thus, the sdaB mutation may synergize with other mutations to confer VAN resistance.O uso intenso e por vezes inapropriado de antibióticos, levou a um aumento à escala mundial de bactérias resistentes, comprometendo seriamente a nossa capacidade de tratar infeções causadas por microrganismos em animais e em humanos. Clostridioides difficile é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbica obrigatória e produtora de esporos. Pode ser encontrada assintomaticamente em 1 a 3% dos adultos saudáveis, podendo causar infeção associada à terapia com antibióticos, essencialmente em ambiente hospitalar, assim como, cada vez mais, na comunidade. É atualmente a principal causa de colite pseudomembranosa e de diarreia infeciosa em países desenvolvidos. Em 2017, um estudo epidemiológico reportou que aproximadamente 45% das infeções gastrointestinais eram causadas por C. difficile. A infeção do cólon por C. difficile é potencialmente fatal, especialmente em idosos e em pacientes que, por terem sido expostos a antibióticos, apresentam disbiose intestinal. A disbiose permite que os esporos ingeridos de C. difficile germinem e que as células resultantes desde que resistentes ao antibiótico em uso, expandam numa população capaz de produzir os dois principais fatores de virulência deste organismo, as toxinas TcdA e TcdB. Estirpes multirresistentes de C. difficile têm sido responsáveis por um aumento de surtos associados a maior morbidade e mortalidade. Certos antibióticos como as fluoroquinolonas, as cefalosporinas e clindamicinas são conhecidos por aumentar o risco da infeção por C. difficile. Para sobreviver no hospedeiro, esta bactéria deve induzir uma estratégia de sobrevivência adequada, que pode ser uma ativação da resposta ao stress, a produção de fatores de virulência (produção de toxinas, camada S, flagelo, fímbrias, etc.), a esporulação ou a formação de biofilmes. Os fatores de virulência TcdA e TcdB, que levam à disrupção do citoesqueleto de actina das células do epitélio intestinal, e à morte celular, causam os sintomas de infeção por C. difficile. A esporulação é um processo de diferenciação de células bacterianas que permite a conversão de células vegetativas em esporos através de uma série de etapas morfológicas. Em C. difficile, a transmissão entre hospedeiros é feita através de esporos, resistentes ao oxigénio. Os biofilmes são comunidades de microrganismos estruturadas associados a superfícies e embebidos numa matriz extracelular, que contém proteínas, DNA e exopolissacáridos. A formação dos biofilmes é importante pois este modo de crescimento resulta numa resistência inerente ao tratamento com antibióticos sendo associado à natureza crónica das infeções. Os fatores de risco associados a infeções por C. difficile podem ser classificados em várias categorias, como farmacológicos (ex.: uso de antibióticos), relacionados com o hospedeiro (ex.: idade ≥ 65 anos e/ou pacientes imunocomprometidos) ou associados com intervenções clínicas (ex.: duração de uma hospitalização). Os tratamentos para pessoas sintomáticas infetadas com C. difficile incluem o transplante de microbiota fecal, as vacinas, os fagos, o tratamento com probióticos e o tratamento com antibióticos. O tratamento com antibióticos causa disbiose permitindo a colonização do trato intestinal por C. difficile. Os principais antibióticos usados para tratar a infeção com C. difficile são o metronidazol e a vancomicina. Contudo, a resistência ao metronidazol, determinada por um plasmídeo, tem vindo a aumentar. A vancomicina é um antibiótico tradicionalmente usado como último recurso para o tratamento de infeções bacterianas Gram-positivas, incluindo casos graves de infeções com C. difficile, mas é cada vez mais usado como medicamento de primeira linha. A disseminação da resistência à vancomicina seria, portanto, um problema sério. O alvo letal da vancomicina é o motivo D-Alanil-D-Ala no lípido II, um intermediário ligado à membrana na via de biossíntese de peptidoglicano (PG). Esta ligação impede as atividades de transpeptidação das sintetases de PG (PBPs, ou proteínas que ligam penicilina), comprometendo a integridade do envelope celular e levando à morte celular. Em vários organismos, a expressão de um cluster designado van é suficiente para conferir resistência à vancomicina. Estes clusters codificam para enzimas que permitem a alteração do motivo D-Alanil-D-Ala para D-Alanil-D-Lac ou D-Alanil-D-Ser, apresentando ambos uma afinidade reduzida para a vancomicina. Os clusters van incluem um regulador transcricional (VanR) que consiste num domínio recetor N-terminal e um domínio de ligação de DNA, e uma cinase sensora (VanS) que contém um domínio N-terminal membranar e um domínio C-terminal citoplasmático de cinase. VanR é ativado através de fosforilação por VanS. Após a exposição à vancomicina, VanS autofosforila e transfere o grupo fosforil para VanR. VanR fosforilado ativa a transcrição da parte “enzimática” do cluster que codifica para as enzimas responsáveis pela introdução de D-Ala-D-Glu ou D-Ala-D-Ser no PG. A suscetibilidade de C. difficile à vancomicina é inesperada porque a maioria das estirpes epidémicas têm um cluster do tipo vanG no qual o gene vanG codifica para uma ligase de D-Alanil-D-Ser, vanXY codifica para uma enzima com atividade hidrolítica contra D-Alanil-D-Ala e UDP-NAG-pentapéptido[D-Ala] e vanT codifica para uma racemase de D-Ser. O cluster de C. difficile é funcional, pois a indução de vanG resulta numa acumulação de NAG-NAM-pentapéptido[D-Ser] na parede celular e o transplante de vanG para E. coli permite a sobrevivência deste organismo na presença de vancomicina. Posto isto, deve haver um ou mais estrangulamentos que impeçam a expressão de resistência à vancomicina em C. difficile. Em 2014, Leeds e coautores reportaram o isolamento de uma estirpe com um valor de MIC de 16 mg L-1, oito vezes superior ao valor normal encontrado para C. difficile. A suscetibilidade reduzida à vancomicina foi atribuída a mutações nos genes murG, CD3659 e sdaB. murG codifica para uma transferase que catalisa a formação de uma ligação glicosídica entre o undecaprenilpirophosphoril-N-acetilmuramoil (NAM)-pentapeptide (lípido I) e a N-acetil glucosamina (NAG) para formar undecaprenil-pirophosphoril-N-acetilmuramoil (NAM)-pentapeptide-NAG (ou lípido II). Este é o substrato que é translocado para o lado trans da membrana e utilizado para a extensão (transglicosila ção) das cadeias de PG. MurG é uma enzima essencial e é conservada em quase todas as espécies bacterianas. O alelo murGP108L, presente na estirpe resistente, causa uma substituição no local de ligação do lípido I, perto da membrana. Isto sugere que MurG pode ter menor afinidade para substratos terminados em D-Ala-D-Ser e que MurGP108 pode utilizar com maior eficiência estes substratos ultrapassando um dos estrangulamentos postulados acima. A mutação em CD3659 introduz um codão STOP após o aminoácido 326 numa exonuclease de RNA/DNA de cadeia simples. A mutação em rpoC causa uma substituição em D244Y, na subunidade β’ da RNA polimerase. Finalmente, sdaB, codifica para uma deaminase que converte L-Ser em piruvato. A mutação causa a liminação em fase de um de quatro resíduos de alanina consecutivos perto do centro ativo e possivelmente interfere com a atividade da enzima. Em E. coli, existem três genes que codificam para deaminases da L-Serina, e a eliminação de todos resulta num forte defeito na forma e na divisão celular. Isto sugere que um aumento na concentração intracelular de L-Ser afeta de algum modo a via de síntese do PG, um dos determinantes mais importantes da forma celular. Embora os mutantes nunca tenham sido estudados em pormenor, o isolamento destas estirpes sugere que a resistência à vancomicina possa surgir através de diferentes mecanismos. No entanto, a contribuição das diferentes mutações para o fenótipo de resistência nunca foi estudada. O principal objetivo deste trabalho foi o de determinar a contribuição de sdaB para a resistência à vancomicina. No processo, estudámos a expressão do gene sdaB durante o crescimento e a esporulação. Concluímos que a expressão de sdaB não responde aos aminoácidos de cadeia ramificada, leucina, isoleucina e valina que controlam a atividade do regulador global CodY. Descobrimos ainda que a expressão do gene sdaB não é afetada num mutante spo0A, incapaz de produzir a proteína, Spo0A, que governa a entrada em esporulação. Em fases tardias do processo, contudo, a expressão do gene parece ocorrer especificamente no pré-esporo, por um mecanismo desconhecido. Construímos um mutante de eliminação em fase do gene sdaB e estudámos os fenótipos associados. A eliminação do sdaB aumenta a resistência de C. difficile à vancomicina. Esta observação sugere um modelo no qual a impossibilidade de produzir piruvato permite canalizar mais L-Ser para a via de síntese de PG, resultando num aumento da representação de D-Ala-Ser e num aumento de resistência à vancomicina. Em apoio deste modelo, a marcação de células vivas com um derivado fluorescente da vancomicina, que marca os motivos D-Alanil-D-Ala no peptidoglicano, é reduzida. A eliminação do gene sdaB aumenta ainda a capacidade de a bactéria formar biofilmes. Em linha com a literatura existente, propomos que reduções nos níveis intracelulares de piruvato induzam a produção dos componentes de um transportador que importa piruvato do meio extracelular, e induz a formação de biofilme. Estes resultados revelam assim uma ligação funcional entre resistência à vancomicina e a formação de biofilmes já que se verifica um aumento da resistência à vancomicina em condições que também promovem a formação de biofilme. Finalmente, produzimos e purificámos SdaB em condições de anaerobiose e iniciámos a sua caracterização bioquímica; SdaB é uma deaminase da L-Serina que exibe um espectro de UV/VIS característico de proteínas com um centro de [4Fe-4S]. Em resumo, os resultados apresentados nesta dissertação sugerem que a disponibilidade de L-Ser pode ser um fator limitante para a resistência à vancomicina, mesmo em condições que induzem o operão vanGCd. Além disso, como parece ocorrer uma maior incorporação de D-Alanil-D-Ser no PG, é possível que a eliminação de sdaB possa interagir com outras mutações, tais como murGP108L, conferindo resistência à vancomicina. Embora não saibamos ainda se esta interação é sinergística ou aditiva, a resistência à vancomicina pode emergir mediante diversos mecanismos e envolver interações entre diferentes mutações. Um entendimento aprofundado dos mecanismos que levam à resistência à vancomicina pode levar à identificação de alvos para novas terapias com o objetivo de aliviar a ameaça representada pelo surgimento e disseminação de estirpes resistentes a este antibiótico