Study on the regulation of the expression of alternative protein isoforms involved in carcinogenesis

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, em 2018In eukaryotes, gene expression is a highly complex process composed of several steps. One of those is translation, the step that converts the genetic information contained in the messenger ribonucleic acid (mRNA) into functional proteins. Under normal conditions, most proteins are translated through the canonical translation initiation mechanism, which starts with cap structure recognition at the 5’-end of mRNAs, followed by 5’ UTR (untranslated region) scanning until the appearance of an initiation codon in a favorable context. Yet, under unfavorable or energy-depriving conditions, such as endoplasmic reticulum (ER) stress, hypoxia, nutrient starvation, mitosis and cell differentiation, canonical translation is impaired and protein synthesis globally decreases. Nevertheless, some mRNAs, usually related to stress-responses, cell growth and cell death control, continue to be translated through alternative mechanisms. One of them involves internal ribosome entry sites (IRES), in which the ribosome is directly recruited to the vicinity of the initiation codon, without requiring the cap structure. This mechanism relies on mRNA secondary structures and can be assisted by some canonical factors and other auxiliary proteins named ITAFs (IRES trans-acting factors). Tumor cells take advantage of this mechanism to cope with the unfavorable conditions that characterize tumor microenvironment and proliferate. Indeed, many mRNAs containing IRES elements are found deregulated in cancer. One example is the tumor suppressor p53. The TP53 gene is the most commonly mutated gene in cancer and surprisingly, p53 mutations usually lead to the production of a mutant protein with oncogenic functions. The presence of three promoters on TP53 gene leads to the expression of different transcripts expressing different alternative translation products: the full-length transcripts allow the expression of FL-p53, Δ40p53 and Δ160p53, and a shorter transcript produces Δ133p53 and also Δ160p53. While FL-p53 and Δ40p53 protein isoforms have been widely studied in terms of internal initiation mechanisms, the fact that Δ160p53 expression is mediated through an IRES element was not known until recently. Since this shorter p53 isoform was already associated with survival, proliferation and invasion of tumor cells, the recently identified Δ160p53 IRES may have an important role in tumorigenic functions of Δ160p53. Thus, considering the aforementioned data, we proposed to study the regulation of the expression of alternative protein isoforms involved in carcinogenesis, more specifically, the regulation of Δ160p53 expression through its IRES element, aiming to understand the role of IRES-mediated translation in cancer development. Knowing that Δ160p53 IRES is located within the first 432 nucleotides of Δ160p53 coding sequence and that its activity is inhibited by Δ160p53 5’ UTR, we evaluated the effect of hotspot p53 missense mutations (R175H, R248Q, R273H e R282W) in reverting the inhibitory effect of Δ160p53 5’ UTR on Δ160p53 IRES activity. To do that, we used a bicistronic system containing two reporter genes: Renilla Luciferase (RLuc) and firefly Luciferase (FLuc). RLuc is the first cistron and its expression is driven by cap-dependent mechanisms, while FLuc is the second cistron and is only translated if there is an upstream sequence capable of promoting its translation through cap-independent mechanisms. In our experiments, we were able to see the inhibitory effect of Δ160p53 5’ UTR on Δ160p53 IRES activity, in HeLa cells, corroborating the previous reported results. Moreover, from all tested p53 missense mutations (R175H, R248Q, R273H e R282W), only R175H was capable of reverting some of the 5’ UTR inhibitory effect on Δ160p53 IRES activity. This was observed for cells under 2 μM Thapsigargin-induced ER stress, which is known to impair cap-dependent translation. The obtained results seem to indicate that R175H oncogenic functions go beyond the alteration or loss of protein function, since this mutation also appears to act through an mRNA-dependent manner by inducing the expression of Δ160p53, an isoform that has already been shown to have importance in promoting tumorigenesis. Furthermore, in this thesis, we also aimed the identification of Δ160p53 IRES auxiliary proteins, using a system that takes advantage of MS2 RNA–MS2 coat protein interaction. Cloning p53 sequences of interest, such as the Δ160p53 IRES, upstream of MS2 RNA repeats, followed by co-transfection of these constructs with that expressing the MS2 coat protein and co-immunoprecipitation, will allow the identification of p53 mRNA-interacting proteins, through mass spectrometry. Here, we describe some of the cloning strategies used, though unsuccessfully, to attempt to clone p53 sequences of interest upstream MS2 repeats as well assome possible solutions. Moreover, knowing that Hdm2 (murine double minute 2 human homolog) interacts with several mRNAs commonly deregulated in cancer cells, such as p53 and XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), regulating their non-canonical translation, we also performed Hdm2 immunoprecipitation optimizations, so that, in the future, co-immunoprecipitation of Hdm2-bound mRNAs can be performed. Then, new possible IRES-containing mRNAs regulated by Hdm2 that may also have a preponderant role in cancer progression will be identified by RNA sequencing. At the end, concluding all these lines of research, we hope to unveil new insights regarding IRES-mediated translation of cancer-related mRNAs. In fact, understanding how IRES-containing mRNAs are regulated under different stress conditions and how the switch between cell homeostasis and cell neoplastic transformation is triggered, will provide important knowledge for the development of new therapeutic strategies.Em eucariotas, a passagem da informação genética contida no ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) para proteínas funcionais envolve uma série de processos que estão física e funcionalmente interligados. Tudo se inicia no núcleo da célula, com a transcrição da informação armazenada no DNA para moléculas de ácido ribonucleico mensageiro prematuro (pré-mRNA, do inglês premature ribonucleic acid). À medida que as moléculas de pré-mRNA vão sendo formadas, estas vão sofrendo modificações que visam a sua estabilização e preparação para as fases seguintes da expressão génica. A estrutura cap (guanina metilada, m7G) é adicionada na extremidade 5’ do pré-mRNA, intrões (regiões não codificantes) são removidos, com consequente junção dos exões (regiões codificantes), num processo designado splicing, e a extremidade 3’ do pré-mRNA sofre poliadenilação. Após este processamento, o mRNA maduro é transportado para o citoplasma, para que a tradução para proteína possa ocorrer nos ribossomas. De uma forma geral, esta inicia-se com a formação do complexo ternário, composto pelo fator de iniciação da tradução (eIF, do inglês eukaryotic translation initiation factor) 2 ligado a uma guanosina trifosfato (GTP, do inglês, guanosine triphosphate) e a uma molécula de RNA de transferência que transporta a metionina da primeira cadeia peptídica (Met–tRNAi, do inglês initiator transfer ribonucleic acid methionine complex). Este complexo liga-se à subunidade ribossomal 40S e a outros eIF, incluindo o eIF4E, que reconhece a estrutura cap. A subunidade menor do ribossoma é, então, posicionada na extremidade 5’ do mRNA para que possa fazer o rastreamento de toda a região não codificante da extremidade 5’ (5’ UTR, do inglês, 5’ -end untranslated region) até que um codão de iniciação em contexto favorável seja identificado. Aí iniciar-se-á a fase de alongamento da tradução com a síntese da cadeia peptídica, após o recrutamento e adição da subunidade ribossomal 60S ao complexo de tradução já existente. Quando o último codão é identificado, a tradução termina e a cadeia peptídica liberta-se do ribossoma. A par com isto, toda a maquinaria de tradução é reciclada, para assegurar novos ciclos de tradução proteica. Em processos biológicos de elevado consumo energético, como a mitose e a diferenciação celular, e em condições de stresse, como a escassez de nutrientes e a hipóxia, esta tradução canónica de proteínas encontra-se comprometida. A redução global da síntese proteica é conseguida, normalmente, pela fosforilação da subunidade α do eIF2 ou pela sequestração do eIF4E, após um dado estímulo, com a consequente inibição da iniciação canónica da tradução. Neste sentido, as reservas energéticas da célula vão ser utilizadas apenas no processo biológico em questão ou na resolução de um dado stresse celular. Tal é conseguido pela expressão seletiva de determinados mRNAs. Estes transcritos, normalmente associados a funções de manutenção da homeostasia celular e a processos-chave da célula, conseguem ser traduzidos para proteína através de mecanismos alternativos de iniciação da tradução. Um desses mecanismos envolve locais de entrada internos do ribossoma (IRES, do inglês internal ribosome entry sites), onde, através de estruturas secundárias no mRNA, de alguns fatores canónicos da tradução e de outras proteínas auxiliares denominadas ITAF (do inglês IRES trans-acting factor), o ribossoma é recrutado para as imediações do codão de iniciação, sem o envolvimento da estrutura cap e sem ser necessário o rastreamento da 5’ UTR do mRNA. Apesar das vantagens deste mecanismo alternativo da iniciação da tradução, uma vez que permite a recuperação da homeostasia celular através da gestão dos recursos energéticos da célula, a tradução mediada por IRES pode também ser nefasta. Por exemplo, as células tumorais aproveitam-se deste mecanismo para ultrapassar as condições adversas que se criam no microambiente tumoral (por exemplo, hipóxia, falta de nutrientes e stresse oxidativo) e proliferar. De facto, muitas das proteínas com expressão desregulada em cancro apresentam IRES no respetivo mRNA. Uma delas é o supressor tumoral p53. A presença de três promotores no gene TP53 leva à expressão de três transcritos: dois longos, que permitem a expressão das isoformas FL-p53 (do inglês full-length p53), Δ40p53 e Δ160p53; e um mais curto, que permite a expressão das isoformas Δ133p53 e Δ160p53. Apesar da existência de dois IRES capazes de regular a expressão das isoformas FL-p53 e Δ40p53 já ser conhecida, tendo já sido caracterizadas e definidas as suas estruturas secundárias, só recentemente foi identificado um IRES capaz de mediar a tradução não canónica do Δ160p53, uma isoforma que aparenta desempenhar funções pró-oncogénicas, na presença de mutações missense no gene TP53. Considerando o exposto, esta tese teve como principal objetivo o estudo da regulação da expressão de isoformas alternativas de proteínas envolvidas no cancro, com especial foco na regulação da expressão da isoforma Δ160p53 através do mais recentemente descrito IRES. Na avaliação da capacidade de uma determinada sequência mediar tradução por IRES é frequente recorrer-se a constructos que contêm dois genes repórteres, designados bicistrónicos. O sistema bicistrónico usado nesta tese contem o gene da luciferase da medusa Renilla reniformis (RLuc, do inglês Renilla luciferase) e o gene da luciferase do pirilampo Photynus pyralis (FLuc, do inglês firefly luciferase). A sequência codificante da RLuc é o primeiro cistrão, sendo por isso traduzida de forma dependente da estrutura cap (tradução canónica), ao passo que a sequência codificante da FLuc forma o segundo cistrão. Entre os dois existe uma estrutura secundária designada hairpin (estrutura em grampo). Deste modo, só ocorrerá tradução da FLuc se a sequência clonada a montante desta conseguir recrutar o ribossoma de forma independente da estrutura cap. O IRES capaz de mediar a tradução não canónica do Δ160p53 localiza-se nos primeiros 432 nucleótidos da região codificante desta isoforma e é inibido pela sua 5’ UTR, ou seja, pela sequência codificante da isoforma Δ133p53 localizada a montante do codão de iniciação do Δ160p53. Tendo isto em mente, propusemo-nos avaliar o efeito das mutações missense mais comuns do TP53 na capacidade de indução da atividade do IRES do Δ160p53 na presença da sua 5’ UTR. Recorrendo, então, ao sistema bicistrónico já descrito, foi possível observar o efeito inibidor da 5’ UTR do Δ160p53 na indução do IRES na linha celular cancerígena HeLa, uma vez que foi observado um aumento significativo da atividade da FLuc na ausência da 5’ UTR do Δ160p53, quando comparado com a atividade desta na presença da 5’ UTR. Mais ainda, de todas as mutações testadas (R175H, R248Q, R273H e R282W), apenas a mutação R175H conseguiu reverter de forma significativa parte do efeito inibitório da 5’ UTR, em condições de stresse induzidas pela Thapsigargina, uma droga que induz stresse do retículo endoplasmático, com consequente fosforilação da subunidade α do eIF2 e inibição da tradução canónica. Tais resultados parecem indicar que as funções oncogénicas da mutação R175H vão além da alteração ou perda de função proteica, uma vez que esta parece também atuar ao nível do mRNA, induzindo a expressão do Δ160p53, uma isoforma que já mostrou ter importância na sobrevivência, proliferação e invasão de células cancerígenas. Continuando a caracterização da regulação da expressão do Δ160p53 pelo seu IRES, pretendíamos ainda identificar proteínas auxiliares da tradução alternativa desta isoforma, recorrendo a um sistema que toma partido das interações entre o RNA e a proteína da cápside do bacteriófago MS2. Clonando sequências de interesse do p53 a montante de repetições da sequência do MS2 e realizando a co-transfeção dessas construções com uma outra que contém a sequência que codifica para a proteína da cápside, seguido de co-imunoprecipitação da cápside e dos mRNAs com as repetições do MS2, seria possível fazer a identificação de novas proteínas reguladoras da expressão das sequências clonadas através de espectrometria de massa. Nesta tese descrevemos várias estratégias de clonagem que foram desenvolvidas para clonar, ainda sem sucesso, as sequências de interesse do p53 a montante de repetições da sequência do MS2, assim como possíveis soluções. Procedemos também a otimizações das condições de imunoprecipitação do Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog), uma proteína que interage com alguns mRNAs cuja expressão se encontra frequentemente alterada no cancro, como o XIAP (do inglês X-linked inhibitor of apoptosis protein) e o p53, regulando a sua tradução não canónica. Com esta técnica pretendemos, no futuro, identificar novos mRNAs regulados pelo Hdm2 através da sequenciação daqueles que co-imunoprecipitarem com esta proteína. Neste sentido visamos identificar possíveis novos mRNAs detentores de IRES que também possam ter um papel preponderante no desenvolvimento tumoral. Concluindo todas estas linhas de investigação, esperamos desvendar novos conhecimentos sobre a tradução mediada por IRES, assim como parte do papel deste mecanismo na carcinogénese. Provando-se a importância dos IRES no cancro, novas terapias direcionadas para estas estruturas secundárias do mRNA ou para as proteínas que auxiliam este mecanismo de tradução podem ser desenvolvidas.