Study of CFTR delivery and stabilization at the plasma membrane

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A fibrose quística (FQ) é a principal doença genética, autossómica recessiva, a afectar a população Caucasiana, embora se estenda igualmente a outras etnias. Apesar de caracterizada no pâncreas pela primeira vez em 1938, a FQ foi sucessivamente associada a defeitos em tecidos epiteliais exócrinos de outros órgãos, nomeadamente dos pulmões, onde se registam os efeitos mais nefastos, os quais incluem acumulação de muco espesso e sensibilidade aumentada a infecções, que normalmente originam complicações conducentes à morte prematura do doente. Só em 1989 foi possível clonar o gene responsável pela doença, então designado cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), o qual codifica um canal selectivo para cloreto (Cl−), também permeável à passagem de hidrogenocarbonato (HCO3 −), expresso na membrana apical dos epitélios que revestem os órgãos afectados. A glicoproteína CFTR é constituída por 1480 resíduos de aminoácidos, de cujo folding resultam três domínios citoplasmáticos – um regulatório central (RD) e dois de ligação a nucleótidos (NBD1 e NBD2) – e dois domínios transmembranares (MSD1 e MSD2). A sua actividade é controlada por (i) ligação de ATP aos domínios NBD, que dimerizam e promovem alterações conformacionais que conduzem à abertura e fecho do canal, e (ii) por fosforilação do seu domínio RD pela PKA, que aumenta ou diminui a probabilidade de abertura. Adicionalmente, a CFTR regula ela própria a expressão e actividade de outras proteínas, de que são exemplo os canais de sódio epiteliais (ENaC), sujeitando-os a alterações de estabilidade e probabilidade de abertura. Estas funções conferem à CFTR um estatuto pleiotrópico. Actualmente sabe-se que diversas mutações, classificadas de I a VI com base no fenótipo celular resultante, estão na origem do desenvolvimento da FQ. Destas, a mais comum, afectando cerca de 90% dos genomas em pelo menos um dos alelos, pertence à classe II e corresponde à delecção de uma fenilalanina na posição 508 da proteína (ΔF508), contida no NBD1. A proteína mutada, CFTR-ΔF508, apresenta defeitos ao nível do folding no retículo endoplasmático (RE), onde é rapidamente degradada, pelo que o seu tráfego vesicular para a membrana plasmática é muito reduzido. Para além disso, a pequena população de canais mutados que escapam ao controlo no RE, sofre de uma instabilidade acrescida na membrana. De facto, o domínio C-terminal da CFTR é capaz de interagir com diversas proteínas contendo pelo menos um domínio PDZ, como é o caso das proteínas NHE-RF1 e CAL, que asseguram a regulação da sua expressão transmembranar. Notavelmente, o adaptador NHERF1 estabelece uma ponte entre o canal e o citoesqueleto de actina filamentosa (F), mediada por proteínas da família Ezrin/Radixin/Moesin (ERM), tendo sido já descrita uma acção estabilizadora do NHE-RF1 sobre a CFTR. Para além destas interacções, também a ubiquitinação do canal na sua região C-terminal e a acção de desubiquitinases como a USP10, que reverte o processo, definem um ponto de controlo da estabilidade da CFTR ao nível da membrana plasmática. O canal é endocitado por um processo dependente de clatrina. No entanto, quando endocitado, é rapidamente reciclado para a membrana plasmática (mais de 75%), o que justifica a sua elevada expressão transmembranar, apesar da baixa taxa de transcrição do seu gene. De forma a possibilitar um tráfego vesicular eficiente, a célula faz uso de uma complexa rede de F-actina, à qual proteínas motoras, como as miosinas, se podem ligar, promovendo o transporte das vesículas. Para além disso, diversas Rab GTPases medeiam a ligação das miosinas às vesículas e são responsáveis pelo seu correcto endereçamento. Neste contexto, já se observou que a CFTR é internalizada em vesículas contendo Rab5a/miosina Va, e reciclada em vesículas com Rab11a/miosina VI. Contudo, nenhuma destas vias parece estar alterada em células com expressão de CFTR-ΔF508 pelo que, para além do misfolding no RE, deverá ser ao nível da própria membrana plasmática, e não do transporte a partir do Golgi, que é induzida uma destabilização adicional do canal mutado. Tanto as proteínas ERM como o adaptador NHE-RF1, referidos acima, encontram-se normalmente numa conformação inactiva no citoplasma. As primeiras, quando activadas, ligam directa ou indirectamente (via NHE-RF1) proteínas transmembranares ao citoesqueleto de actina. Esta activação depende de dois factores: a ligação do seu N-terminus ao fosfatidilinositol 4,5- bisfosfato (PIP2) e a fosforilação de resíduos críticos de treonina na região Cterminal. A actividade de um grupo de pequenas GTPases da subfamília Rho, nomeadamente as GTPases canónicas Rac1, Cdc42 e RhoA, tem sido implicada tanto no metabolismo do PIP2 como na fosforilação das proteínas ERM, pelo que se pensa que a sua acção esteja implicada na activação destas proteínas. Para além disso, estas Rho GTPases também promovem alterações no citoesqueleto que podem condicionar o desempenho do processo de transporte sub-membranar de vesículas, ou seja, a endocitose e a reciclagem de proteínas como a CFTR. Por seu turno, o NHE-RF1 é activado por fosforilação, por exemplo mediada pela PKC, ou por ligação de proteínas ERM ao seu C-terminus, de forma que as Rho GTPases acabam, indirectamente, por também poderem ter um papel na activação do adaptador ao activarem as proteínas ERM. O presente estudo foi conduzido em duas fases, separadas pela utilização de dois modelos celulares: uma linha estavelmente transfectada com o gene CFTR normal (BHK-wt) e uma outra com o gene mutante CFTR-ΔF508 (BHK- ΔF). Começámos por realizar um ensaio de precipitação, com partículas de agarose revestidas com streptavidina, de CFTR marcada com biotina na sua porção extracelular. Para tal trataram-se células BHK-wt com Sulfo-NHS-Ssbiotina a 0 °C (para bloquear os processos de endocitose e exocitose), com vista a averiguar se a expressão transiente de mutantes constitutivamente activos (CA) ou dominante negativos (DN) das três Rho GTPases canónicas induziam alterações na expressão da CFTR na membrana plasmática. Descobrimos que, nestas células, tanto o Rac1-CA como o RhoA-CA aumentavam os níveis de CFTR à superfície das células, e que os seus mutantes DN os diminuíam significativamente. A observação, por imunofluorescência (IF), de células transfectadas nas mesmas condições, não só corroborou estes resultados como mostrou que nas células transfectadas com RhoA-DN havia uma acumulação de CFTR no Golgi, sugerindo uma acção do RhoA no tráfego do canal deste compartimento para a membrana plasmática. Estes resultados indicavam que Rac1 e RhoA poderiam exercer o seu efeito através de mecanismos diferentes pelo que, a fim de averiguar se estes incluíam alterações no processo de endocitose e/ou reciclagem da CFTR, utilizámos um ensaio de biotinilação modificado no qual células transfectadas com mutantes activos de RhoA ou Rac1, depois de biotiniladas a 0 °C, foram brevemente repostas a 37 °C por diferentes períodos de tempo, de modo a reactivar o tráfego vesicular, permitindo-nos assim seguir a cinética de internalização da CFTR. Observámos que enquanto o Rac1-CA provocava um marcado retardamento da endocitose da CFTR (2.0 ± 0.74% CFTR internalizada por minuto, contra 12.0 ± 1.80% para o controlo, transfectado com vector vazio), o RhoA-CA não o fazia (9.0 ± 1.8%, p > 0.05), estimulando, pelo contrário, a reciclagem do canal para a membrana. Estando já descrita a importância do adaptador NHE-RF1 na ancoragem da CFTR na superfície celular, realizámos um ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) dos complexos NHE-RF1/CFTR em células transfectadas com ambas as formas CA e DN das Rho GTPases Rac1 e RhoA e constatámos que, enquanto o Rac1-CA induzia, de facto, um incremento notável na formação dos complexos, o RhoA-CA não apresentava efeitos significativos. Por outro lado, se a redução da actividade do Rac1 produz apenas uma redução parcial na associação NHE-RF1/CFTR, já a diminuição da actividade do RhoA reduz notoriamente esta associação, o que é uma vez mais concordante com um papel desta GTPase no tráfego da CFTR do Golgi para a membrana plasmática, situação na qual ocorre a ligação inicial de NHE-RF1 à CFTR. Analisámos também a actividade global da população de canais na membrana através de um ensaio de efluxo de iodeto (I−). Neste, células BHK-wt transfectadas como na co-IP, previamente incubadas numa solução de NaI, foram estimuladas com Forskolina e IBMX (dois agentes que aumentam os níveis de cAMP na célula, activando a PKA, que fosforila e activa a CFTR) a expelir o I−, detectado com um eléctrodo específico. Observámos que tanto a activação do Rac1 como do RhoA aumentavam a actividade da CFTR, de acordo com o incremento na expressão membranar do canal observado logo na fase inicial do presente estudo. Pelo contrário, o uso dos mutantes Rac1-DN e RhoA-DN diminuiu significativamente a actividade da CFTR, também concordante com os dados dos ensaios de precipitação e IF. Na segunda fase, usando o modelo celular de FQ, com excepção dos ensaios da cinética de internalização e da co-IP, por limitações técnicas devidas à reduzida quantidade de CFTR na membrana plasmática, os restantes ensaios referidos acima foram conduzidos em células BHK-ΔF transfectadas com os mutantes CA de Rac1 e RhoA. Observámos que apenas a activação do Rac1 conseguia um aumento tanto da expressão de CFTR na membrana plasmática (precipitação com streptavidina) como da sua actividade global (ensaio de efluxo de I−). Estes incrementos foram confirmados por IF, observando-se claramente uma pequena mas notória acumulação de CFTR na membrana plasmática. O mutante RhoA-CA, por outro lado, não induziu quaisquer alterações relativamente ao controlo em nenhum dos ensaios. O presente trabalho contribuiu para a compreensão dos mecanismos de acção de duas Rho GTPases na expressão e actividade da CFTR ao nível da membrana plasmática de células epiteliais não polarizadas. Com os dados obtidos, articulados com outros da literatura, propomos um modelo de acção para cada GTPase. No que respeita ao RhoA, a sua activação conduzirá à formação de fibras de actomiosina, propícias ao desenrolar dos movimentos de transporte vesicular da CFTR de (endocitose) e para (reciclagem) a membrana plasmática. Estas fibras, constituindo filamentos complexos, em tensão, não formam redes de F-actina que permitam a formação estável de complexos CFTR/NHE-RF1/ERM por ancoragem ao citoesqueleto, não contribuindo, portanto, para a estabilização do canal na membrana mas sim, como vimos, para o aumento da sua taxa de reciclagem. No caso do Rac1, quando activo induz a formação de redes de F-actina na região cortical (mais periférica) das células, permitindo uma maior associação da CFTR com o adaptador NHE-RF1, como observado, formando os complexos referidos acima e justificando, em parte, uma endocitose menos eficiente e, desta forma, retardada. Para além disso, o Rac1 parece ter um papel preponderante no ajustamento dos níveis de PIP2 na célula, contribuindo directamente para a activação das proteínas ERM e, indirectamente, para a do adaptador NHE-RF1. Infelizmente, o simples aumento da actividade do Rac1 não serve o propósito de terapia para a FQ, uma vez que está descrita a sobre-expressão da GTPase em tumores pulmonares. Devem, portanto, ser realizados no futuro ensaios com efectores a juzante do Rac1 a fim de estabelecer se poderão ser usados como alvos terapêuticos em doentes com FQ.Cystic fibrosis (CF), the major autosomal recessive genetic disorder among Caucasians, is caused by mutations in the CFTR gene, which codes for an epithelial chloride-selective channel. Its most common ΔF508 mutation leads to protein misfolding and trafficking impairment, and interferes with CFTR’s stability at the plasma membrane (PM). Both processes associate with increased protein degradation, either through quality control at the endoplasmic reticulum or at the cell surface. Particularly at the latter, interactions between the channel and PDZcontaining proteins, such as CAL or NHE-RF1, and the activity of deubiquitinizing enzymes like USP10, seem to regulate CFTR’s expression at the PM. The Ezrin/Radixin/Moesin (ERM) family of cytoskeleton linkers for transmembrane proteins indirectly anchors CFTR to filamentous (F) actin via interaction with CFTR-bound NHE-RF1 (Na+/H+-Exchanger Regulatory Factor 1). In order to achieve this, ERM proteins first need to be activated by phosphoinositide binding and/or threonine phosphorylation, both proposed to depend on small Rho GTPase activity. Moreover, Rho GTPases play a role in cytoskeleton and F-actin content rearrangements just beneath the PM, whereto CFTR is usually internalized and from where it recycles back to the surface. Using iodide-efflux, biotin pull-down, immunoprecipitation, and immunoflurescence methodologies, we found that although both active Rac1 and RhoA GTPases increased CFTR’s cell surface levels and activity, Rac1 acted by enhancing CFTR/NHE-RF1 complex formation, impairing the channel’s internalization and thus favouring its PM stability, whereas RhoA stimulated CFTR’s recycling but not NHE-RF1-mediated PM tethering. Moreover, using a CF cell line model, we show that only active Rac1 was able to increase CFTR- ΔF508 surface levels and activity, possibly by downregulating the accelerated internalization rate of the mutant channel capable of reaching the PM . These efforts establish new roles for Rac1 and RhoA GTPases on CFTR PM expression and indicate Rac1 downstream effectors as potential CF therapeutic targets