Regulation of neural stem cell proliferation and differentiation by apoptosis-relevant factors

Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012Neural stem cell (NSC) fate decision is controlled by both intrinsic and extrinsic factors. Mounting evidence supports the hypothesis that apoptosis-associated factors modulate NSC proliferation and differentiation. Therefore, we set to identify and characterize new apoptosis-associated factors regulating NSC fate decision, and to modulate related pathways using novel regulators of apoptosis. We started by evaluating the ability of synthetic naphthoquinone derivatives naphtho[2,3-d]isoxazole-4,9-dione-3-carboxylates 1a and 1b to prevent cell death in different cellular models. Notably, under apoptogen stimulation, both 1a and 1b increased cell viability, promoted up-regulation of Bcl-XL, and reduced nuclear fragmentation, caspase-3, -8 and -9 activation, and cytochrome c release. These results indicate that 1a and 1b may act as efficient modulators of apoptotic pathways. We next investigated the potential NSC modulatory properties of calpains, a family of cysteine proteases largely associated with apoptosis. Our results showed that inhibition of calpains, possibly regulated by calcium, favored NSC differentiation and elicited changes in cell cycle-related proteins. We found higher calpain 1 expression in self-renewing NSC, while calpain 2 levels increased throughout differentiation. Specific silencing of each calpain suggested that calpain 1 plays a role in repressing differentiation and maintaining a proliferative NSC pool, while calpain 2 may be involved in glial differentiation. Finally, we evaluated whether naphthoquinone derivatives could modulate NSC proliferation and differentiation potential. Interestingly, treatment of differentiating NSC with 1a elicited a shift from neuronal to glial differentiation, not through modulation of apoptosis-associated cysteine proteases, but rather through reactive oxygen species production. This was associated with activation of the antioxidant-response proteins Nrf2 and Sirt1 and partly reduced by subsequent antioxidant treatment, suggesting that 1a modulates NSC fate through alteration of the intracellular redox environment. In conclusion, these studies contribute to an integrated view of neural differentiation, proliferation and apoptosis pathways in cell fate decision and may prove useful in the development of stem cell-based therapeutic strategies.As células estaminais são células indiferenciadas que se conseguem replicar e originar células especializadas e funcionais, através de processos de diferenciação celular. Existem vários tipos de células estaminais, originárias de tecidos embrionários e adultos, caracterizadas por possuirem potenciais de diferenciação diferentes. As células estaminais neurais (NSC) têm a capacidade de originar os principais tipos de células neurais, incluindo neurónios e células da glia (astrócitos e oligodendrócitos). Em cada divisão celular, as NSC podem seguir destinos celulares diferentes, nomeadamente continuar o processo proliferativo, ou iniciar o processo de diferenciação. Esta tomada de decisão é regulada por vários fatores intrínsecos e extrínsecos. Além disso, os mecanismos regulatórios envolvem também sinais de sobrevivência e de morte celular, sendo que o destino de proliferação, diferenciação ou morte depende do balanço e da conjugação dos múltiplos fatores. Estudos recentes sugerem que fatores associados ao processo apoptótico podem também modular a proliferação e a diferenciação das NSC. De facto, o nosso grupo demonstrou já que as caspases, proteases de cisteína que desempenham um papel central no processo apoptótico, bem como a proteína p53, supressora de tumores, aceleram a diferenciação neural. Por outro lado, também demonstrámos o envolvimento de vários miRNAs associados à apoptose na diferenciação neural e clarificámos o papel do miRNA-34a durante este processo. Curiosamente, as variações na expressão e atividade de proteínas e miRNAs relacionados com a apoptose não se encontram associadas a um aumento de morte celular, o que sugere que estes fatores desempenham novas funções na regulação da diferenciação das NSC, independentemente do seu papel proapoptotico. Assim, propusémo-nos identificar e caracterizar novos fatores, associados à apoptose, com capacidade de regular o potencial de proliferação e diferenciação das NSC e, também, modular estes processos recorrendo a novos reguladores de vias apoptóticas. Avaliámos, inicialmente, a capacidade de dois derivados de naftoquinona sintéticos regularem a apoptose em diferentes modelos celulares. De facto, compostos com uma estrutura de quinona são comuns na natureza e apresentam actividades anticancerígenas, antibacterianas, antimaláricas e fungicidas. Dois compostos com o potencial de inibir proteases de cisteína foram concebidos e sintetizados: nafto[2,3- d]isoxazole-4,9-diona-3-carboxilatos 1a e 1b. O potencial antiapoptótico dos compostos 1a e 1b foi avaliado e comparado com o da naftoquinona 4, um composto estruturalmente mais simples. Culturas primárias de hepatócitos de rato foram incubadas com os derivados de naftoquinona sintetizados e, posteriormente, tratadas com camptotecina, um estímulo tóxico proapoptótico que induz danos no DNA. Os nossos resultados demonstraram que os derivados de naftoquinona 1a e 1b conferem uma proteção antiapoptótica eficaz nestas condições, ao contrário da naftoquinona 4. Tanto o composto 1a, como o composto 1b, aumentaram significativamente a viabilidade celular e reduziram a fragmentação nuclear, a ativação da caspase-3, -8 e -9 e a libertação de citocromo c, provocadas pelo tratamento com camptotecina. Além disso, ambos os compostos aumentaram a expressão da Bcl-XL, uma proteína pró-apoptótica da família da Bcl-2 que modula a via mitocondrial da apoptose. Avaliámos a extensão das propriedades antiapoptóticas destes compostos a outros modelos, por recurso a linhas celulares e estímulos apoptóticos diversos. Obtivémos efeitos protetores semelhantes em hepatócitos primários de rato e em células HuH-7 de hepatoma humano expostas a TGF-β1, uma citocina próapoptótica. Verificámos ainda que as propriedades antiapoptóticas dos derivados de naftoquinona 1a e 1b não se restringem a células do fígado, uma vez que ambos os compostos se revelaram eficazes na proteção de células de feocromocitoma de rato (PC12) tratadas com rotenona, um inibidor da cadeia respiratória mitocondrial. Estes resultados sugeriram que os nafto[2,3-d]isoxazole-4,9-diona-3-carboxilatos 1a e 1b são agentes citoprotetores eficazes e potenciais moduladores de vias apoptóticas. De seguida, investigámos a função de proteínas associadas à apoptose na regulação do potencial de proliferação e diferenciação das NSC. Uma vez que tínhamos confirmado anteriormente o efeito das caspases na diferenciação neural, investigámos agora outra família de proteases de cisteína, as calpaínas. As calpaínas dependem de cálcio para a sua ativação e já foram associadas a vários processos celulares, incluindo a apoptose, a migração e o ciclo celular. Também já foram implicadas em processos de diferenciação em diversos modelos celulares, mas o seu impacto na diferenciação neural é ainda pouco conhecido. Assim, começámos por inibir estas proteases em NSC de ratinho. Tratámos as NSC com calpeptina, um inibidor químico de calpaínas, ou, em alternativa, sobrexpressámos a calpastatina, um inibidor endógeno específico para as calpaínas. Verificámos que esta inibição resultou em redução de proliferação e indução de diferenciação das NSC. Este efeito foi acompanhado por alterações significativas na expressão de proteínas do ciclo celular. Experiências com inibidores de canais de cálcio presentes no retículo endoplasmático sugeriram que as calpaínas são ativadas por fluxos de cálcio nas NSC. De seguida, focámos o nosso estudo nas calpaínas mais estudadas e, também, mais abundantes no cérebro, as calpaínas 1 e 2. Curiosamente, observámos que estas duas isoformas são reguladas de modo díspar durante a diferenciação das NSC. A análise da expressão das duas proteínas indicou que a calpaína 1 é mais expressa nas NSC, decrescendo os seus níveis de expressão durante a diferenciação. Por outro lado, os níveis de calpaína 2 aumentaram ao longo da diferenciação celular. De facto, a redução da expressão de cada uma destas proteínas, recorrendo à tecnologia de silenciamento com siRNAs, resultou em efeitos radicalmente diferentes. O silenciamento da calpaína 1 acelerou o processo de diferenciação neural, marcado pelo aumento de expressão de marcadores neuronais e gliais, respectivamente β-III tubulina e GFAP. O silenciamento da calpaína 2, contudo, traduziu-se numa diminuição de expressão da proteína GFAP. Estes resultados sugerem que a calpaína 1 poderá ter um papel na manutenção da proliferação das NSC, reprimindo a diferenciação, e que a calpaína 2 poderá estar mais envolvida na diferenciação de células da glia. Por fim, avaliámos o efeito dos derivados de naftoquinona, previamente descritos, na regulação do destino celular das NSC. De facto, os compostos 1a e 1b apresentavam características promissoras, uma vez que foram sintetizados enquanto inibidores de proteases de cisteína, para além de que os resultados anteriores mostraram que as caspases e as calpaínas são potenciais moduladores do destino celular. Experiências preliminares sugeriram que, mais uma vez, os compostos 1a e 1b apresentavam propriedades semelhantes, pelo que apenas um dos compostos foi utilizado neste estudo. Verificámos que o tratamento com 1a resultou numa alteração do potencial de diferenciação das NSC, favorecendo a gliogénese em detrimento da neurogénese. Contudo, a modulação da atividade de caspases e calpaínas, através da adição de inibidores químicos, não reproduziu este efeito, o que indica que o papel do 1a nas NSC é independente da modulação destas proteases. Uma vez que as naftoquinonas são moléculas electrofílicas e pro-oxidantes, avaliámos também a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) nas NSC após tratamento com 1a. Os resultados demonstraram que o derivado de naftoquinona promove um aumento de ROS nestas células, associado a um aumento de expressão e à translocação nuclear de proteínas de resposta antioxidante, como Nrf2 e Sirt1. A alteração do estado redox das NSC poderá ser um dos principais mecanismos pelos quais o composto 1a modula a diferenciação das NSC. De facto, a adição de antioxidantes reverteu, ainda que parcialmente, a alteração no potencial de diferenciação das NSC induzida pelo derivado de naftoquinona, reduzindo a geração de ROS e a translocação nuclear das proteínas Nrf2 e Sirt1. Assim, estes estudos revelaram uma nova função do derivado de naftoquinona 1a na modulação do destino celular das NSC, sublinhando a importância do ambiente redox neste processo. Em conclusão, estes estudos contribuem para uma visão integrada dos processos de proliferação, diferenciação e apoptose, bem como do seu papel no destino das células, que poderá revelar-se útil no desenvolvimento de estratégias terapêuticas com células estaminais neurais.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/42008/2007 e projetos PTDC/SAU-FCF/67912/2006, PTDC/SAUNMC/ 117877/2010, Pest-OE/SAU/UI4013/2011) e FEDER (Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional