Clostridium difficile infection: molecular and epidemiology study

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Clostridium difficile is the leading cause of antibiotic-associated diarrhea in developed countries. Elderly hospitalized patients taking antibiotics are the main group at risk of infection. Since 2000, several countries have reported an increased incidence and severity of CDI associated with the emergence of the epidemic RT027. This clone produces Toxin A (TcdA), Toxin B (TcdB) and an additional binary toxin, Clostridium difficile transferase (CDT), has a deletion at position 117 in the tcdC gene (negative regulator of toxin production) and is highly resistant to fluoroquinolones. However, CDI epidemiology is highly variable, as other hypervirulent RTs have also started to emerge, and is still largely unknown in our country. In the present study, 286 C. difficile strains sent from 22 Portuguese hospitals were characterized regarding PCR ribotype, toxin profile, tcdC mutations, antimicrobial susceptibility to MXF, VAN, MTZ, IMP, RIF and TGC, and mechanisms of antimicrobial resistance. Most patients (73.4%) were aged ≥65 years and at least 54.9% had taken antibiotics in the previous months; 76.5% of the cases were healthcare facility-associated (HCFA) and 12.6% were community-associated (CA). Among the 84 distinct RTs found, RT027 was the most frequent (22%), followed by RT014 (8%), RT020 (5%), RT203 (5%), RT017 (4%), RT078 (3%) and RT126 (3%). RT027 was also predominant in the HCFA cases (26%), while RT014 was the most common in CA cases (16.7%). Most strains (96.1%) were toxinogenic, 31.8% were cdtA/cdtB+ and 29% had an extensively truncated TcdC, either due to the deletion Δ117A (23.1%) or the substitution 184C→T (5.9%) in tcdC. Twenty strains were tcdA-/tcdB+. In total, 11 were non-toxinogenic. MXF-resistance was observed in 95 (33.8%) strains, mainly from RT027 (62/95) and RT017 (9/95) but also from common RTs (RT014, RT020) and other non-RT027 cdtA/cdtB+ strains. Most MXF-resistant strains had mutations in GyrA, one of which, D-81→N, not previously described. RIF-resistance was found in 6.7% of the strains, most from RT017, and all exhibited previously described mutations in RpoB. Low level MTZ-resistance was found in 13 (4.6%) strains and RT027 exhibited reduced susceptibility to MTZ when compared to other RTs (geometric mean MIC of 0.79 mg/L vs 0.16 mg/L; t test, p<0.01). Two strains were low-level VAN-resistant and all were TGC-susceptible. The ermB and tetM genes were present in 37 (12.9%) and 43 (15.0%) strains, respectively, being that 26 (9.1%) contained both genes and most RT027 strains (60/63) were ermB-/tetM-. All strains were catD-. The IMP-resistance rate was 19.3% and seven mutations (not previously described) were identified near the conserved motifs of PBP1 in five IMP-resistant strains. These results raise awareness for the high frequency of RT027 but also for the emergence of other hypervirulent RTs, such as RT078 and RT126 that exhibited a truncated TcdC, as well as for the circulation of MXF-resistant strains. Antimicrobial resistance was also observed in other RTs, particularly the multidrug resistant TcdA-/TcdB+ RT017.Clostridium difficile é uma bactéria de gram-positivo, anaeróbia obrigatória e produtora de esporos que representa atualmente a principal causa de colite pseudomembranosa e de diarreia infeciosa em países desenvolvidos, estando associada ao meio hospitalar e à toma de antibióticos. Esta bactéria foi descoberta em 1935 nas fezes de recém-nascidos e identificada como não-patogénica e integrante da flora colónica saudável. Como tal, o seu papel etiológico na colite pseudomembranosa só foi identificado mais tarde, em 1978, na sequência de múltiplos trabalhos conduzidos na década de 1970, quando esta patologia se tornou mais frequente devido ao aumento no consumo de antibióticos. Os principais fatores de risco para a aquisição da infeção por C. difficile (ICD) são idade superior a 65 anos, hospitalização recente e toma de antibióticos. Desde 2000, vários países começaram a reportar um aumento na incidência da ICD assim como vários surtos, aumento da gravidade da infeção e taxas de reincidência e mortalidade superiores às registadas até então. Esta mudança na epidemiologia da ICD foi associada à emergência de uma nova estirpe epidémica denominada ribotipo 027 (RT027) que surgiu inicialmente no Canadá, mais tarde nos EUA e posteriormente na Europa. Esta estirpe é principalmente caracterizada por i) uma elevada resistência às fluoroquinolonas, cuja aquisição foi concomitante com o início da sua propagação epidémica; ii) produzir ambas as Toxinas A (TcdA) e B (TcdB), que constituem os principais factores de patogenicidade em C. difficile; iii) produção de uma toxina binária (CDT) que apenas está presente em determinadas estirpes e cujo papel na patogénese de C. difficile é ainda desconhecido; e ainda por ter uma deleção na posição 117 do gene tcdC, que é o regulador negativo da produção de TcdA e TcdB, levando à produção de uma proteína truncada e consequentemente à produção de elevadas quantidades de TcdA e TcdB, comparativamente com estirpes que não têm esta mutação. A epidemiologia da infeção por C. difficile é altamente variável entre países, nomeadamente em relação aos ribotipos predominantes e aos padrões de resistência a antimicrobianos. O primeiro surto associado ao RT027 em Portugal foi reportado em 2014, contudo existem poucos estudos sobre esta questão no nosso país e o paradigma da infeção a nível nacional é desconhecido. No presente estudo, 286 amostras de fezes (correspondentes a 286 pacientes diagnosticados com infeção por C. difficile) foram enviadas de 22 hospitais portugueses abrangendo as cinco regiões de Portugal Continental. As estirpes de C. difficile isoladas destas amostras foram caracterizadas molecularmente e fenotipicamente quanto ao ribotipo de PCR, genes das toxinas, mutações no gene tcdC, suscetibilidade à fluoroquinolona moxifloxacina (MXF), vancomicina (VAN), metronidazol (MTZ), imipenem (IMP), rifampicina (RIF) e tigeciclina (TGC), aferida por Etest e também pelo método de diluição em agar no caso do IMP, e mecanismos de resistência a antimicrobianos. A maioria dos pacientes (73.4%) tinha ≥65 anos e pelo menos 54.9% tinha tomado antibióticos nos três meses precedentes ao diagnóstico de ICD; 76.5% dos casos foram associados ao meio hospitalar e 12.6% foram associados à comunidade. Entre os 84 diferentes ribotipos encontrados no total das estirpes, o RT027 foi o mais frequente (22%), seguido do RT014 (8%), RT020 (5%), RT203 (5%), RT017 (4%), RT078 (3%) e RT126 (3%). O RT027 foi também o mais frequente entre as estirpes de casos associados ao meio hospitalar (26%), ao passo que o RT014 foi o mais comum nos casos associados à comunidade (16.7%). A maioria das estirpes eram toxinogénicas, 31.8% eram também cdtA/cdtB+ e 29% continham um TcdC extensamente truncado com apenas 61 ou 65 resíduos de aminoácidos (comparativamente com o TcdC não-truncado de 232 resíduos), quer devido à deleção Δ117A (23.1%), típica do RT027, quer devido à substituição 184C→T (5.9%), presente noutros ribotipos hipervirulentos, como RT078 e RT126, que levam à inserção de codões stop prematuros. Vinte estirpes eram TcdA-/TcdB+, 12 das quais pertencentes ao RT017, sendo que 10 dessas estirpes continham uma deleção de cerca de 1800 pb em tcdA e em duas não houve amplificação em tcdA, indicando uma deleção mais extensa no gene. No total, 11 estirpes eram não-toxinogénicas. Observou-se resistência à MXF em 95 (33.8%) estirpes, a maioria das quais pertencente aos RT027 (62/95) e RT017 (9/95), contudo também foram identificadas estirpes de outros ribotipos comuns (RT014, RT020) e outros cinco ribotipos CDTA/CDTB+ que não o RT027. A maioria das estirpes resistentes à MXF continha mutações em GyrA, nomeadamente as já descritas T-82→I e D-426→N e uma ainda não descrita anteriormente, D-81→N, encontrada numa estirpe do RT020. A resistência à RIF foi observada em 6.7% das estirpes, sendo a maioria do RT017. Em 14 estirpes resistentes à RIF, 13 continham as mutações H-502→N e R-505→K em RpoB (já anteriormente descritas), e uma continha apenas a mutação R-505→K. Observou-se um baixo nível de resistência ao MTZ (3-16 mg/L) em 13 estirpes (4.6%), sete das quais pertencentes ao RT027. Para além disso, o RT027 registou uma suscetibilidade reduzida ao MTZ comparativamente às estirpes de outros ribotipos (média geométrica da concentração mínima inibitória = 0.79 mg/L vs 0.16 mg/L; teste t, p