The role of Haemophilus influenzae as a colonizer and its impact on invasive infection

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021Haemophilus influenzae is a Gram-negative bacterium that colonizes the human upper respiratory tract, where it can remain asymptomatically. It can also progress from colonizer to pathogen and cause mucosal or invasive infections. Although most circulating isolates are nonencapsulated, six different capsular serotypes (a-f) have been described. Until the worldwide implementation of the H. influenzae serotype b (Hib) vaccine, Hib was a common cause of serious diseases in children. The epidemiology of this bacterium has changed significantly ever since. The aim of this study was to unravel epidemiological aspects of H. influenzae colonization in healthy children in Portugal and compare the results with those obtained from isolates recovered from invasive disease (clinical isolates). With that purpose, nasopharyngeal samples collected in 2015 and 2016, from 625 children, under 7 years of age, attending day care centers in Oeiras, were cultured and tested for the presence of putative H. influenzae. All isolates obtained (n=515) were subjected to a specific PCR reaction for identification of capsule and characterization of capsular serotype. βlactamase production was tested in all isolates, and susceptibility to other antibiotics was determined in β-lactamase producers (n=48), in encapsulated isolates (n=23) and in isolates obtained from children who were taking β-lactam antibiotics during sampling (n=12). Antimicrobial susceptibility was determined by broth microdilution methodology, according to the guidelines of the “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” (EUCAST, 2020). Genetic characterization using whole genome sequencing (WGS) analysis was performed for encapsulated isolates. Multilocus sequence type (MLST) was determined in silico and an assembly-free core-SNP-based phylogenetic tree was constructed with the genomes of the encapsulated isolates obtained in this study and genomes of encapsulated isolates from invasive disease in Portugal (n=31). Mutations associated with resistance, as well as the presence and absence of virulence genes, were analyzed in encapsulated isolates from asymptomatic colonization from this study and compared with similar data from encapsulated isolates from invasive disease. The majority of children (82.4%) were colonized by putative H. influenzae, most of them nonencapsulated isolates (NTHi) (95.5%). A capsule was identified in 23 isolates, seven of which were characterized as serotype e (Hie) (1.4 %) and 16 as serotype f (Hif) (3.1%). Among the 515 isolates obtained, 48 were β-lactamase producers (9.3%). Among the latter, 66.7% showed resistance to at least one other antibiotic besides ampicillin. A higher percentage of β-lactamase-producing isolates was found in children who took β-lactam antibiotics during the month prior to sampling compared to children who did not (13.6% and 8.2%, respectively). Regarding the encapsulated isolates, the maximum likelihood phylogenetic tree and the MLST profiles revealed a low genetic variability: Hie belonged to sequence types (ST) ST18 and ST122, and Hif to ST124, ST973 and ST2346, a new ST profile characterized in this study. Phenotypic resistance profiles were consistent with genotypic resistance mutations detected, except for one isolate that was phenotypically resistant to cefepime, but without any associated mutation in the ftsI gene encoding the transpeptidase domain of the penicillin-binding protein 3. Most virulence genes that were associated with specific structures or functions, namely iron acquisition, adherence, biofilm development or immune evasion, were present in all isolates. Some genes, specifically hifABCD and tbpB, were present in only one and two invasive isolates, respectively, but absent in all other isolates of the same serotype, which indicates that they may have been acquired by horizontal transfer, possibly from other H. influenzae strains.Haemophilus influenzae (H. influenzae) é uma bactéria Gram-negativa restrita ao Homem, que se encontra frequentemente como colonizadora do trato respiratório superior, onde pode permanecer assintomaticamente. A sua disseminação a partir do local de colonização pode levar a infeções nas mucosas, como otite média, sinusite, bronquite e pneumonia. H. influenzae pode invadir a mucosa e entrar na corrente sanguínea, causando doenças invasivas graves, como bacteriemia, meningite, celulite, artrite séptica, pericardite purulenta e epiglotite, entre outras. As infeções por H. influenzae são mais comuns nas crianças com menos de 5 anos de idade, ou em indivíduos com o sistema imunitário debilitado, e são geralmente tratadas com antibióticos β-lactâmicos. A maioria dos isolados em circulação não expressa uma cápsula; no entanto, foram descritos seis serotipos capsulares diferentes, designados de a a f, de acordo com a composição e antigenicidade do seu polissacárido capsular. A cápsula é considerada um importante fator de virulência de H. influenzae, sendo o serotipo capsular b (Hib) considerado o mais virulento. A epidemiologia da infeção por esta bactéria mudou significativamente em diversos países após a implementação da vacinação contra Hib nos programas de imunização. Observou-se, desde então, um declínio acentuado das infeções causadas por Hib, assim como o declínio da colonização por este serotipo. Os estudos relativos à infeção por H. influenzae podem ser divididos em dois períodos: pré-vacinação e pós-vacinação. Em Portugal, a vacina para o Hib foi implementada no Programa Nacional de Vacinação no ano 2000. Existem estudos em isolados clínicos, provenientes de doença invasiva em Portugal, com discriminação de serotipo capsular e determinação de suscetibilidade a antibióticos, nos períodos pré e pós vacinação. No entanto, não existem estudos que caracterizem da mesma forma isolados de colonização assintomática dos dois períodos, mais especificamente do período pós-vacinação. Os objetivos do presente estudo foram esclarecer alguns aspetos epidemiológicos da colonização por H. influenzae em crianças saudáveis em Portugal, caracterizando-se fenotípica e molecularmente isolados provenientes de colonização assintomática e comparando-se os resultados obtidos com isolados provenientes de doença invasiva. Estes isolados foram caraterizados no que se refere à suscetibilidade aos antimicrobianos, presença ou ausência de genes de virulência e serotipos capsulares. O presente estudo foi realizado em sete infantários, localizados na zona de Oeiras, tendo sido analisadas 625 amostras da nasofaringe de crianças com idades compreendidas entre os cinco meses e os sete anos. O isolamento em meios de cultura seletivos e a observação da morfologia das colónias permitiu-nos identificar presuntivamente 515 isolados de H. influenzae. A deteção da presença de cápsula e a sua posterior caracterização foi realizada por PCR. A produção de β-lactamase foi testada em todos os isolados utilizando nitrocefina. A suscetibilidade aos antimicrobianos foi determinada nos isolados produtores de β-lactamase (n=48), nos isolados capsulados (n=23) e nos isolados de crianças que estavam a tomar algum antibiótico β-lactâmico aquando da amostragem (n=12). A suscetibilidade à ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefuroxima, cefotaxima, cefepima, meropenem, ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, rifampicina e trimetoprim/sulfametoxazol foi determinada de acordo com as diretrizes do “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” (EUCAST, 2020) pelo método de microdiluição em placa. Para a caracterização genotípica, foi realizada a sequenciação do genoma completo (em inglês whole-genome sequencing, WGS) dos isolados capsulados. Para a montagem da sequência do genoma, controlo de qualidade e determinação do perfil de “Multilocus Sequence typing” (MLST), foi utilizado o software INNUca v4.2.2. Construiu-se uma árvore filogenética de máxima verossimilhança entre polimorfismos de nucleotídeo único (em inglês single nucleotide polymorphism, SNPs) do genoma “core” dos isolados capsulados obtidos neste estudo e dos isolados provenientes de doença invasiva em Portugal (n=31). Foi determinada a presença ou ausência de genes de virulência através do software ABRicate e foram pesquisadas mutações associadas a resistência aos antimicrobianos. A maioria das crianças que frequentavam os infantários estava colonizada por H. influenzae (82,4%), sendo que a prevalência de colonização variou entre os grupos etários, aumentando até aos 12-24 meses de idade e decrescendo sucessivamente nos grupos etários seguintes (de 24-36 a 60-75 meses). Este resultado é consistente com o de outros estudos de colonização realizados em infantários. A maior parte dos isolados eram não capsulados (NTHi, 95,5%), no entanto foram identificados 23 isolados capsulados (4,5%): sete do serotipo e (Hie, 1,4%) e 16 do serotipo f (Hif, 3,1%). Nenhuma criança estava colonizada com Hib. Não foi encontrada uma diferença significativa na prevalência de colonização por H. influenzae entre as crianças que tomaram antibióticos durante o mês anterior à amostragem e as crianças que não tomaram: 80,9% e 82,8%, respetivamente (p=0,72). Entre os 515 isolados obtidos, 48 eram produtores de β-lactamase (9,3%). Destes, 66,7% eram resistentes a, pelo menos, um outro antibiótico para além da ampicilina; um destes isolados foi considerado multirresistente por ser simultaneamente resistente a três classes de antibióticos. Foi encontrada uma percentagem superior, embora não significativa, de isolados produtores de β lactamase em crianças que tomaram antibióticos β-lactâmicos durante o mês anterior à amostragem, em comparação com crianças que não o fizeram: 13,6% e 8,2%, respetivamente (p=0,19). Entre os isolados não produtores de β-lactamase provenientes de crianças que estavam a tomar antibióticos β lactâmicos no momento da amostragem, 33,3% apresentaram menor suscetibilidade à ampicilina, 41,7% eram resistentes à cefuroxima, um antibiótico frequentemente utilizado no tratamento de infeções por H. influenzae, e um isolado era multirresistente. Pela análise de resultados de WGS dos isolados capsulados, o perfil de resistência fenotípica aos antibióticos foi consistente com os determinantes de resistência genotípica detetados, exceto para um isolado resistente à cefepima, sem qualquer mutação associada no gene ftsI que codifica o domínio transpeptidase da proteína de ligação à penicilina 3 (PBP3). Nos dois isolados resistentes à cefuroxima, foram detetados determinantes de resistência no gene ftsI relacionados com o perfil de resistência apresentado e, nos dois isolados resistentes ao trimetoprim/sulfametoxazol, foram detetados determinantes de resistência no gene folA e folP associados à resistência fenotípica a trimetoprim/sulfametoxazol. A árvore filogenética de máxima verossimilhança e os perfis de MLST revelaram uma baixa variabilidade genética entre os isolados de colonização: as estirpes Hie foram caracterizadas como ST18 ou ST122, e as estirpes Hif foram caracterizadas como ST124, ST973 ou ST2346 (um novo perfil alélico descrito neste estudo). Os STs mais comuns dos isolados Hie e Hif caracterizados neste estudo de colonização coincidiram com os STs mais frequentemente caracterizados entre os isolados de doença invasiva, Hie e Hif em Portugal, ST18 e ST124 respetivamente. A maioria dos genes de virulência que estavam associados a estruturas ou funções importantes para o estabelecimento da colonização por H. influenzae, nomeadamente aquisição de ferro, adesão, desenvolvimento de biofilmes ou evasão imunitária, estavam presentes em todos os isolados. Alguns genes, especificamente hifABCD e tbpB, estavam presentes em apenas um e dois isolados invasivos, respetivamente, mas ausentes em todos os outros isolados do mesmo serotipo, o que indica que podem ter sido adquiridos por transferência horizontal, provavelmente a partir de H. influenzae. H. influenzae é um colonizador comum da nasofaringe, especialmente em crianças entre os 12 e 24 meses de idade que frequentam infantários, e pode causar infeções crónicas e infeções invasivas graves. Como a colonização antecede a doença e, como temos verificado a ocorrência de casos de doença invasiva em Portugal provocada por H. influenzae serotipo b e um aumento anual de casos de infeções invasivas provocadas por H. influenzae na Europa, a caracterização genotípica e fenotípica dos isolados de colonização assintomática em circulação na população portuguesa permitirá estabelecer e melhorar as estratégias de prevenção da doença invasiva. Ao determinar a prevalência da resistência de H. influenzae a determinados agentes antimicrobianos será possível otimizar a resposta relativamente ao tratamento empírico destas graves infeções