Characterization of biofilm formation in clinical isolates of Clostridioides difficile

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2021Clostridioides difficile (anteriormente conhecido como Clostridium difficile) é um microrganismo de coloração Gram-positivo, anaeróbio obrigatório, produtor de endósporos, toxinas e biofilme, capaz de colonizar o intestino humano provocando uma infeção (ICD). Normalmente associada a um contexto hospitalar, esta infeção tem uma sintomatologia semelhante à da doença inflamatória do intestino, com sintomas que vão desde diarreia ligeira ou moderada, à colite fulminante. Podendo afetar qualquer parte do cólon, é mais frequente no segmento distal. Em casos mais graves pode causar desidratação, distensão abdominal, megacólon tóxico, perfuração do cólon, paralisia intestinal, síndrome de resposta inflamatória sistémica, septicémia e, em casos severos, morte. Alguns dos fatores de risco associados a esta doença incluem a idade do paciente e a terapia com antibióticos acompanhada de hospitalizações prolongadas. No entanto, existe outra forma da doença, associada à comunidade, cujos fatores de risco são desconhecidos. Especula-se que estes estejam relacionados com o aumento de prescrições de antibióticos a pacientes não hospitalizados, a um aumento no número de portadores assintomáticos e à contaminação dos alimentos ou água. De acordo com o Centro Europeu para a Prevenção e Controlo de Doenças (ECDC) entre 2011 e 2012 foram identificados cerca de 124 000 casos de ICD associada ao contexto hospitalar, sendo esta na altura considerada a oitava infeção nosocomial mais frequente na Europa. Em 2017, nos EUA, a ICD foi considerada uma ameaça à saúde pública tendo sido registados cerca de 223 900 casos. Para além do impacto na qualidade de vida dos pacientes, esta doença atinge também a economia dos países afetados, com um custo anual de 3 mil milhões de euros na Europa e aproximadamente mil milhões de dólares nos EUA. A doença apresenta ainda o desafio da reincidência. A taxa de reincidência é elevada, 15% a 35% dos pacientes diagnosticados com ICD sofrem uma nova infeção após tratamento bem-sucedido. Para que a infeção ocorra é necessário que os endósporos (doravante designados por esporos) sejam ingeridos. Estas células sobrevivem na presença de oxigénio e desinfetantes, e às barreiras gastrointestinais do hospedeiro. Quando chegam ao intestino, e se as condições forem favoráveis, germinam, multiplicam-se e infetam o hospedeiro. Durante a infeção, C. difficile produz toxinas que provocam danos nos tecidos, sendo esta a causa primária dos sintomas da doença. A produção de esporos no trato gastrointestinal permite não só a disseminação da bactéria no ambiente, mas também a sua permanência no hospedeiro. No intestino de um adulto saudável, a microbiota é composta maioritariamente por Bacteroidetes e Firmicutes, responsáveis por diversas transformações metabólicas e regulação da resposta imunitária. Um pequeno grupo destas bactérias é capaz de fazer uma reação enzimática, 7α-dehidroxilação, que converte os sais biliares primários, como o colato (CA), em secundários, como o deoxicolato (DOC), que normalmente se encontram conjugados com taurina ou glicina. Os sais biliares, quer sejam primários ou secundários, induzem a germinação dos esporos de C. difficile. No entanto, apenas alguns dos sais biliares primários permitem o seu crescimento vegetativo. Estes e outros subprodutos do metabolismo bacteriano previnem a colonização de C. difficile. Contudo, num estado de disrupção da microbiota conhecido como disbiose, a presença destes metabolitos diminui enquanto os seus precursores aumentam, promovendo a colonização de C. difficile e consequente infeção. Este estado de disbiose é provocado por terapias com antibióticos, aos quais C. difficile é resistente. Para além dos esporos, C. difficile é capaz de produzir biofilme, uma estrutura que protege as bactérias de insultos externos, como antibióticos, e permite uma convivência em comunidade. Tal como noutras bactérias, a matriz extracelular é composta por exopolissacáridos (EPS), DNA extracelular (eDNA) e proteínas. Dentro do biofilme existem vários tipos de células, entre as quais, células esporulantes, que podem atuar sinergisticamente com o biofilme e permitir a permanência da bactéria no hospedeiro, mesmo após o tratamento da infeção. Estirpes de C. difficile toxina A-negativa/toxina B-positiva que causam doença em humanos têm sido isoladas com frequência crescente em todo o mundo, nomeadamente estirpes multirresistentes pertencentes ao ribotipo (RT) 017. Em Portugal o ribotipo 017 tem uma taxa de incidência de 10%, mas a sua epidemiologia não é bem compreendida. Estão identificadas três sublinhagens (denominadas por A, B e C) deste ribotipo a circular em Portugal, que possuem elementos genéticos distintos. Um dos objetivos deste trabalho foi a caracterização de estirpes deste ribotipo na expectativa de contribuir para a compreensão da sua epidemiologia e emergência em Portugal. Caracterizámos fenotípica- e genotípicamente 13 estirpes RT017, isoladas de diversos hospitais, analisando o seu perfil de resistência a antibióticos, a eficiência de esporulação e germinação, as características dos esporos, a sua produção de biofilme e a taxa de crescimento. Foi selecionado um painel de oito antibióticos: vancomicina, metronidazol, rifampicina, clindamicina, imipenem, eritromicina, tetraciclina e moxifloxacina. Todas as estirpes analisadas foram consideradas multirresistentes, sendo apenas sensíveis à vancomicina e ao metronidazol, usados no tratamento de ICD. Foram observadas algumas exceções como a estirpe CD470, sensível ao imipenem e à moxifloxacina, CD1214, CD1649 e CD1976, sensíveis à tetraciclina, e CD97435, sensível à moxifloxacina. Estas exceções estão relacionadas com a ausência de mutações e/ou genes que conferem resistência a estes antibióticos. Observámos diferentes eficiências de esporulação: 60% a 80%, correspondem a boas produtoras de esporos (CD157, CD392, CD470, CD1017, CD1045, CD1089, CD1517 e CD97435), e 10% a 30%, correspondem a fracas produtoras de esporos (CD324, CD678, CD1214, CD1649 e CD1976). No que respeita à eficiência de germinação observaram-se dois fenótipos: eficiências semelhantes (CD157, CD324, CD470, CD678, CD1214, CD1517, CD1649, CD1976 e CD97435) e superiores (CD392, CD1017, CD1045 e CD1089) à estirpe de referência 630Δerm. Procurámos também caracterizar as camadas mais externas dos esporos. Após extração destas camadas, observámos por SDS-PAGE que os padrões das bandas eram semelhantes entre todas as estirpes do RT017. Caracterizámos em maior detalhe, através de um ensaio de imunodeteção, quatro proteínas ricas em resíduos de cisteína, CdeA, CdeB, CdeC e CdeM, que constituem o exosporo (camada mais externa dos esporos de C. difficile). Por fim, todas as estirpes produziram mais biofilme após 48 h, com a exceção das estirpes CD470, CD1976 e CD97435 que produziram mais após 24 h. Estas diferenças não são, no entanto, explicadas por diferenças na taxa de crescimento, uma vez que estas são semelhantes entre si. Durante a análise do genoma de cada estirpe, em comparação com a estirpe de referência para o ribotipo 017 (M68) detetámos apenas 87 polimorfismos (SNPs) indicando uma elevada conservação do genoma. Foi possível também agrupar as estirpes conforme os polimorfismos partilhados, coincidindo parcialmente com as sublinhagens a que pertencem. No primeiro grupo encontram-se as estirpes: CD1017, CD1089, CD1517 e CD1976; partilham 23 SNPs e pertencem à sublinhagem C, à exceção da CD1017, que pertence à sublinhagem A. No segundo grupo encontram-se as estirpes: CD157, CD324, CD392, CD678, CD1045, CD1214 e CD1649; partilham 25 SNPs e pertencem à sublinhagem A. As estirpes CD470 (sublinhagem B) e CD97435 (sublinhagem A) destacaram-se das restantes por serem a que mais se assemelha e difere da estirpe M68, respetivamente. Apesar da análise efetuada não encontrámos uma correlação entre os SNPs no genoma nuclear das estirpes e os fenótipos observados. O segundo objetivo principal deste trabalho foi a identificação de componentes proteicos da matriz do biofilme. Para tal começámos por caracterizar a produção de biofilme de 27 estirpes clínicas e de animais da cadeia alimentar de diferentes ribotipos predominantes em Portugal (RT005, RT014, RT020, RT027, RT039, RT078, RT085, RT106 e RT126). As estirpes foram classificadas com base na produção de biofilme às 48 h como: baixa (DO600nm ≤ 16), média/alta (DO600nm = [16, 24]) e alta (DO600nm ≥ 16). A estirpe CD1560 foi selecionada para extração das proteínas da matriz por produzir grandes quantidades de biofilme. A identificação por espectrometria de massa destas proteínas revelou que a maioria são enzimas citoplasmáticas envolvidas em vias metabólicas. Das 13 proteínas identificadas três tinham um péptido sinal previsto na sua sequência (CdtB, OppA e 3-hidroxilbutiril-CoA desidrogenase); duas não possuíam este sinal, mas a sua localização à superfície da célula já foi demonstrada (piruvatoferrodoxina oxidoredutase e proteína chaperona DnaK); as restantes sete proteínas eram citosólicas. Especulamos que, como noutros patógenos, em vez de produzir componentes dedicados da matriz, C. difficile usa proteínas citoplasmáticas para formar a matriz extracelular. Esses resultados serviram como base para descobrir os principais determinantes genéticos e celulares da morfogénese do biofilme e deste comportamento social em C. difficile.Clostridioides difficile (formerly Clostridium difficile) is the major causative agent of hospital-born infections associated with antibiotic therapy in adults. Due to the production of two main cytotoxins, this organism causes a range of intestinal diseases from mild diarrhoea to life-threatening conditions. C. difficile is also emerging as an important pathogen in the community and zoonotic transmission is a raising concern. About 15% to 35% of C. difficile infections (CDI) lead to disease recurrence. Moreover, with an excess of 130 000 cases in the US and Europe combined, yearly, a massive economic burden is imposed on health care systems worldwide. C. difficile is a strict anaerobe spore-forming organism resistant to several broad-spectrum antibiotics. The highly resistant spores allow persistence in the host, are linked to recurrence and allow host-host transmission. Moreover, C. difficile forms biofilms, and spores can be formed within biofilms. Whether this organism persists in the intestine after cessation of antibiotic treatment as biofilms, spores, or spores within biofilms is unknown. In any case, antibiotic- and immune system-resistant biofilms able to disperse in the form of highly resistant spores, appear as a serious threat. C. difficile toxin A-negative/toxin B-positive strains that cause disease in humans have been isolated with increasing frequency worldwide, namely the multidrug resistant ribotype (RT) 017. In Portugal, the RT017 has an incidence rate of 10%, but its emergence and epidemiology are poorly understood. In this work we have phenotypically characterized 13 strains from this ribotype, all isolated from Portuguese hospitals, concerning sporulation, biofilm formation and antimicrobial susceptibility. Whole genome sequencing (WGS) and single nucleotide polymorphism (SNP) analysis was also performed. More than half of these strains produced high levels of spores, had germination efficiencies that ranged from 60% to 70%, all produced biofilm and were resistant to multiple antibiotics. Together with the WGS information, our results may help point to genes that are involved in the high incidence rate of this ribotype. Another goal of this work was to identify biofilm matrix associated proteins. The composition of the C. difficile biofilm matrix is unknown. However, matrix proteins are likely a key point of contact between the bacteria and the host immune system, and thus, characterizing the composition of the matrix is of paramount importance. We characterized 27 strains from different ribotypes (RT005, RT014, RT020, RT027, RT039, RT078, RT085, RT106 and RT126), commonly found in Portuguese patients as well as in animals of the food chain, and classified them as low, medium /high and high biofilm producers. Strain CD1560, a high bio film producer, was selected for extraction of the matrix proteins which were identified by mass spectrometry. We found that the matrix is largely composed of cytoplasmic proteins. We hypothesize that, like other pathogens, rather than having a dedicated set of matrix proteins, C. difficile uses cytoplasmic proteins to form the extracellular matrix. These results serve as a foundation to uncovered key genetic and cellular determinants of biofilm development a key social behaviour in C. difficile