항 백혈병 백혈병 효능을 가진 Stemphol과 6-acetylmonodethiogliotoxin의 분자 기전

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 약학대학 약학과, 2018. 2. Marc Diederich.병원균의 감염이나 상처등이 발생했을 때 chemokine이나 cytokine은 leukocyte의 이동을 유도하여 염증 반응을 일으킨다. 이러한 염증 반응은 외부 유래의 병원균이나 상처등으로부터 우리 몸을 보호하는데 유용한 역할을 하지만 한편으로는 암의 발생과 성장을 촉진하기도 한다. 염증반응은 성장 인자, 항사멸 단백질 (anti-apoptotic factors), extracellular-matrix–modifying enzymes 들을 과발현 시킴으로써 종양 세포의 비정상적인 성장과 전이를 촉진하는 등 종양미세환경을 구축하는데 이바지 한다. 이러한 특징으로 인해, 염증은 종양 발생의 중요한 인자로 인식되고 있다. NK-kB는 염증 반응 신호전달의 핵심 조절자이다. 자극 인자의 종류에 따라서 신호 전달 양상에 변화가 생기는데 각기 다른 NK-kB 신호전달 체계에 대해서 심도 있는 연구가 진행되어 왔다. Canonical NK-kB 신호 체계는 미생물 감염이나 IL-1, TNF-α와 같은 proinflammatory cytokine들에 의해서 활성화된다. 신호 전달 체계에 의해서 IKK 복합체와 IkB의 인산화가 일어나고, 프로테아좀에 의한 IkB의 분해가 시작된다. 마지막으로 IkB에 의한 억제가 사라진 p65/p50 복합체는 핵 내로 이동하고 proinflammation과 관련된 많은 인자들을 전사하게 된다. 이에 반해, Alternative NK-kB 신호 체계는 TNF-α 대신, lymphotoxin b (TNFSF3), CD40 ligand (CD40L and TNFSF5), cell activating factor (BAFF and TNFSF13B) 등에 의해 활성화되게 된다. 이어서 NIK (NF-kB–inducing kinase)에 의해 IKK 복합체, p100의 인산화가 순차적으로 일어나고 최종적으로 p52–RelB 복합체가 proinflammation 관련 인자들의 발현에 관여하게 된다. 인간의 몸에서 가장 흔한 미네랄 이온인 칼슘은 인간의 생명 현상을 이어가기 위해서 필요한 다양한 생리학적, 생화학적 반응에 관여한다. 이를테면, secondary messenger로써 근육 수축, 신경 전도, 호르몬 방출, 혈액 응고를 직간접적으로 조절하는데 필수적인 역할을 수행한다. 따라서, 칼슘 이온은 항상 일정한 농도로 유지되어야 하며 보통 혈장 내 2.5 mM (오차범위 20%), 세포 외 공간 (extracellular space)에 1.2 mM, 세포 내에는 50 에서 100 nM 사이로 항상성을 유지하고 있다. 이렇게 인간의 생명 현상을 위하여 필수적인 역할을 하는 칼슘 이온은 그 항상성이 깨질 경우 신호 전달 체계의 교란을 가져오고 결국 세포 사멸을 일으킨다. 소포체와 미토콘드리아는 세포 내 칼슘 이온을 조절하는데 중추적인 역할을 하는 세포 소기관으로 세포 사멸과 밀접한 관련이 있다. 소포체는 세포 소기관중 가장 큰 칼슘 이온의 저장고 역할을 하며, 평상시 100-500 nM 의 칼슘 농도를 유지하고 있다. 특히 소포체 내 칼슘 이온의 항상성에 문제가 생기면 단백질 접힘에 결함이 발생하고 이는 곧 caspase와 calpain 의존적인 세포사멸을 일으키게 된다. 특히 최근 연구에 따르면, 소포체 내 칼슘의 뷸균형은 미토콘드리아의 칼슘 유입에 영향을 주고 그 정도가 심해지게 되면 non-canonical 세포사멸이 일어나게 된다. mPTP (mitochondrial permeability transition pore)-의존적 necrosis는 미토콘드리아 내 칼슘이온의 과부하로 일어나는 대표적인 non-canonical 세포사멸이다. 그 과정을 간단히 살펴보면, 소포체 스트레스에 의해 소포체의 칼슘 이온이 미토콘드리아의 칼슘 과부하를 촉진하고 mPTP 개방을 유도하게 된다. 개방된 틈 사이로 1.5 kDa 이하의 용질이 유입되면서 미토콘드리아의 물리적 구조가 파괴되고, 결국 programmed necrosis 를 일으키게 되는 것이다. 최근 연구에 의하면, 종양 세포의 미토콘드리아는 정상 세포에 비하여 높은 칼슘 이온 농도를 유지하고 있고 특히 소포체와 미토콘드리아내 활발한 칼슘의 이동이 있음이 규명됨으로써, 종양 세포의 생존과 칼슘 의존성에 관한 흥미로운 연관성을 제공하고 있다. 여러 의/과학의 기술적 진보에도 불구하고, 여전히 암의 완치는 인류가 극복해나가야 난제 중 하나이다. World Cancer Research Fund International의 보고서에 따르면, 2035년에는 2천 4백만명 정도의 암환자가 발생할 것으로 예상되고 있다. 이와 관련, 본 연구는 효율적인 암 치료 방법을 제시하고 실질적인 항암제 개발에 기여하기 위하여, 종양 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 NF-kB와 칼슘이온을 타겟으로 하는 천연물 유래 물질들의 항암효과와 기전을 연구하였다. 먼저, gliotoxin의 NF-kB저해 효과를 규명하였던 기존 연구를 바탕으로 gliotoxin 유도체들의 항 NF-kB 효과를 확인하였다. 4가지 다른 유도체 중 3가지에서 효율적인 NF-kB저해 효과를 확인하였고 가장 강력한 효과를 나타낸 6-acetylmonodethiogliotoxin 을 중심으로 관련 기작을 연구하였다. TNF-α를 이용하여 NF-kB 활성화를 유도하였고, p65의 DNA binding affinity 저해효과를 관찰함으로써 6-acetylmonodethiogliotoxin의 target을 명확히 규명할 수 있었다. 또 다른 천연물인 Stemphol (STP)은 암 세포에 작용하여 apoptosis 및 necrosis 세포 사멸을 동시에 유발하는 식물유래 천연물질이다. 특히 백혈병 중에서 만성 골수성 백혈병 (CML)에 비해 환자의 예후가 좋지 못한 급성 골수성 백혈병 (AML)를 종양 모델로 하여 기작 연구를 진행하였다. 이를 통하여, STP가 thapsigargin과 유사하게 세포질 내 Ca2+ 레벨을 증가시킴을 관찰하였고, 이는 apoptosis의 중요한 원인임을 규명하였다. 특히, STP가 일으키는 또 다른 세포사멸 형태인 necrosis와 관련하여, 미토콘드리아의 Ca2+ 과부하가 그 원인임을 구명하였고, 이는 mitochondrial permeability transition pore (mPTP)의 개방에 의존한다는 것을 입증하였다. 마지막으로, STP가 처리 된 AML 환자 세포에서 면역원성 세포 사멸의 중요한 지표자인 HMGB1의 방출을 관찰함으로써 이 천연물의 면역원성 세포사멸 및 중계연구의 가능성을 제시하였다. 본 연구를 통해 NF-kB와 칼슘 이온이 암 치료의 효과적인 타겟이 될 수 있음을 증명하였고, 연구에 사용된 천연물들의 구조와 기능에 대한 추가적인 연구가 동반된다면 항암제 치료제 개발에 이바지 할 수 있을 것으로 기대된다.CHAPTER 1. Literature review 1 1.1. Cancer 2 1.1.1. Definition 2 1.1.2. Status of cancer occurrence 4 1.1.3. Developmental stages 6 1.1.4. Treatment 8 1.2. Inflammation 10 1.2.1. Inflammation and cancer 10 1.2.2. NF-κB signaling 10 1.2.3. Pharmacological NF-κB inhibitors 15 1.3. Calcium regulation 15 1.3.1. Physiological role 15 1.3.2. Calcium and cancer 17 1.3.3. Calcium and cell death 18 1.3.4. Pharmacological calcium modulators 19 1.4. Non-Edible Source of Compounds with Chemopreventive and Chemotherapeutic Potential 22 1.4.1. The categorization of natural compounds 22 1.4.2. The relationship between approved anti-cancer drugs and the source of the natural compounds 23 1.4.3. The effect of natural compounds from non-edible sources on cancer chemoprevention and chemotherapy 25 1.4.4. Conclusion 30 CHAPTER 2. Epipolythiodiketopiperazines from the marine derived fungus Dichotomomyces cejpii with NF-κB inhibitory potential 33 2.1. Abstract 34 2.2. Introduction 35 2.3. Materials and methods 37 2.4. Results 42 2.5. Discussion 51 CHAPTER 3. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in leukemia 53 3.1. Abstract 54 3.2. Introduction 55 3.3. Materials and methods 56 3.4. Results 65 3.5. Discussion 97Docto