Geleneksel Yoğurtlardan Starter Bakterilerin İzolasyonu, Moleküler Tanımlaması Ve Bazı Özelliklerinin Belirlenmesi

The fermentation process of starter cultures is one of the most important factors of chemical, physical and biological changes that occur during the transformation of milk into yoghurt. In this thesis, it was aimed to identify genotypic/proteomic and some characteristics of starter cultures, which will be used for production of high- nutritional-value functional foods with high economic and social benefits. For this purpose 39 local yoghurt samples produced by traditional methods in Bolu, Mersin, Amasya, Isparta and Kayseri regions, were collected and inoculated and into the agar media. After incubation period 283 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus and 101 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus suspected isolates have been isolated. These colonies were stored for further analysis but 153 S. thermophilus and 28 Lb. bulgaricus suspected isolates were reactivated. 53 S. thermophilus, 23 Lb. bulgaricus and 49 S. thermophilus, 22 Lb. bulgaricus strains were identified according to the results of MALDI-TOF MS and real-time PCR analyses, respectively. Strains identified by MALDI-TOF MS and real-time PCR were subjected to 16S rRNA sequence analysis and 1 S. thermophilus, 9 Lb. bulgaricus were confirmed. A total of 61 S. thermophilus and 21 Lb. bulgaricus strains identified by MALDI-TOF MS or/and real-time PCR were used in order to determine their sensivity to antibiotics such as streptomycin, gentamicin, penicillin G, chloramphenicol, linkomycin, chlortetracycline, tetracycline, ampicillin and roxithromycin with the minimal inhibitor concentration (MIC) by macro dilution tube method. The results showed that the highest sensitivity was found to be 98.4% and 81% of the strains of S. thermophilus and Lb. bulgaricus against ampicillin, respectively. All strains of S. thermophilus were resistant to gentamicin while Lb. bulgaricus strains were resistant to streptomycin and chloramphenicol. It was concluded that 26.2% of S. thermophilus and 42.9% of Lb. bulgaricus strains were sensitive to tetracycline. One S. thermophilus (St27) and 7 Lb. bulgaricus (Lb25, Lb29, Lb46, ML4-1, ML7-6, ML9-5 ve ML9-6) isolates which were identified with three methods, have been researched their effect on the natural immune system, allergic response and immune system cells. In the study using THP-1 macrophages and K562 (natural killer cells) cell lines; TNF-α, IL-8 and IL-10 cytokine responses were evaluated after stimulation of cells with selected LAB. Increase in TNF-α and IL-8 cytokine levels in the interaction of S. thermophilus isolate with K562 cell line and increase in IL-8 level and decrease in IL-10 cytokine level in interaction with THP-1 cell line were detected. The obtained data showed that the two study results are compatible with each other. Besides that, it has been determined that the selected LAB isolates are different from the responses they stimulate in both cell types and increase the proliferation of monocytes and natural killer cells. A decrease in the level of IL-8 cytokine was detected in some LABs, TNF-α cytokine levels in THP-1 monocytic cell lines and 2 LABs isolates in K562 natural killer cell line. The interaction of ML7-6 and ML4-1 isolates with the THP-1 cell line leads to an increase in IL-10 cytokine levels. The obtained results, which suggest that these four isolates have promoting effects of the immune system and suppress the allergic response.Bilim, Sanayi ve Teknoloji Bakanlığı/TÜBİTAK tarafından desteklenen “Geleneksel Yoğurt Örneklerinden İzole Edilen Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus Suşlarının Endüstriyel Yoğurt Üretimine Uygunluğunun Saptanarak Starter Kombinasyonlarının Geliştirilmesi” isimli ve 112D052 kodlu SAN-TEZ projesi tarafından desteklenmiştir.ÖZET ………………………………………………….…………...…………………….....i ABSTRACT ..……………………………………………………………………………...iii TEŞEKKÜR ………………………………………….………………………...……….....v İÇİNDEKİLER ...…………………………………………………………..………………vi ÇİZELGELER ..…………………………………….……………………………………viii ŞEKİLLER …..……………………………………….……………………………………x SİMGELER VE KISALTMALAR ..……………………………………………………..xiii 1.GİRİŞ ...…...……………………………………………………………………………..1 2.LİTERATÜR ÖZETİ ……………………………………………………………………5 3.MATERYAL VE METOT ...………………………….………………………………..41 3.1.Materyal ..……………………………………………………….…………………...41 3.1.1. Yoğurt Örnekleri ...………………………………………….……...…………….41 3.1.2. Besiyeri, Kimyasallar ve Antibiyotikler ……………………………………...….41 3.1.3. DNA İzolasyonu ..…………………………………………………….…………..43 3.1.4.Gerçek-zamanlı PZR ile Tanımlama ……………………………………………44 3.1.5. Antibiyotik Dirençlilik Testi ………………………………………………………46 3.2.Metot ....………………………………………………………………………………47 3.2.1. Besiyerlerinin Hazırlanması ...……………………………………………….....47 3.2.2.Streptococcus thermophilus ve Lactobacillus bulgaricus Bakterilerinin İzolasyonu ve Stok Kültür Hazırlanması ………………………………………………47 3.2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması ……………………………………….48 3.2.4. İzolatların MALDI-TOF MS ile Tanımlanması …………………………………49 3.2.5. LAB Kültürlerinden DNA İzolasyonu ……………………………………………51 3.2.5.1. Lizozim (liyofilize formdan) Hazırlanması …………………………………..51 3.2.5.2. Lambda Buffer Hazırlanması …………………………………………………52 3.2.5.3. PBS (Fosfat Tamponlu Su) Hazırlanması……………………………………52 3.2.6. İzolatların Gerçek-Zamanlı PZR ile Tanımlanması …………………………..54 3.2.6.1. Primer Seçimi ………………………………………………………….……….56 3.2.6.2. Gerçek-zamanlı PZR Master Mix Hazırlanması………………………..……56 3.2.6.3. Örnek DNA’nın Eklenmesi ……………………………………………...….…56 3.2.7. Sekans Analizi ……………………………………………………………………57 3.2.8. %6.5 NaCI Testi ……………………………………………………….…………58 3.2.9. Laktik Asit Bakterilerinin Antibiyotik Dirençliliklerinin Belirlenmesi…………..58 3.2.9.1. Magnezyum Stok Çözelti Hazırlanması ……………………………………..58 3.2.9.2. Kalsiyum Stok Çözelti Hazırlanması …………………………………………59 3.2.9.3. Katyon Ayarlı Müller Hinton Broth Hazırlanması……………………………59 3.2.9.4. Antibiyotik Stok Çözeltisinin Hazırlanması ………………………………….59 3.2.10. Hücrelerin Hazırlanması ve Deney Protokolü……..………………………....63 3.2.11. THP-1 Makrofaj Hücre Kültürü ………………………………………………..63 3.2.12. THP-1 Hücrelerinin Makrofajlara Farklılaşmasının Belirlenmesi ………….64 3.2.13. Sitokin Düzeylerinin Ölçümü …………………………………………………..64 4. BULGULAR VE TARTIŞMA ………………………………………………………...65 4.1. Örnekleme ve İzolasyon …………………………………………………………..65 4.2. MALDI-TOF MS ile Tanımlama …………………………………………………..70 4.3. %6.5 NaCI Testi ……………………………………………………………………75 4.4. Gerçek-Zamanlı PZR ile Tanımlama …………………………………….…….…76 4.5. 16S rRNA Sekans Analizi ile Tanımlama ………………………………………..79 4.6. Antibiyotik Duyarlılık Testi …………………………………………………………90 4.7. İmmün Sistem Yanıtları …………………………………………………………..102 4.8. İzolatların NK Hücreleri ve THP-1 Makrofajları ile Etkileşimi Sonuçları………103 4.9. Sitokin Yanıtları …………………………………………………………………...111 5. SONUÇLAR……………………………………………………………………........117 KAYNAKLAR……………………………………………………………………..….…120 EKLER……………………………………………………………………………....…..134 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………….…….…152Sütün yoğurda dönüşümü sırasında meydana gelen kimyasal, fiziksel ve biyolojik değişikliklerin en önemli etkenlerinden biri kullanılan starter kültürlerin fermantasyon sürecidir. Bu tez çalışmasında, ekonomik ve toplumsal faydanın, besinsel kalitenin üst düzeyde olduğu ürünlerin elde edilmesinde kullanılacak starter kültürlerin, yerel kaynaklardan izole edilerek, genotipik/proteomik olarak tanımlanması ve bazı özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bolu, Mersin, Amasya, Isparta ve Kayseri bölgelerinde, geleneksel yöntemlerle üretilen 39 yoğurt örneğinden besiyerlerine yapılan ilk ekimde 283 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, 101 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus şüpheli kolonisi elde edilmiştir. Daha sonra incelenmek üzere tekrar besiyerlerinde aktive edilen kolonilerden 153 S. thermophilus ve 28 Lb. bulgaricus şüpheli izolatı tespit edilmiştir. MALDI-TOF MS ile yapılan analizlere göre 53 S. thermophilus, 23 Lb. bulgaricus, gerçek-zamanlı PZR ile yapılan analiz sonuçlarına göre 49 S. thermophilus, 22 Lb. bulgaricus suşu tanımlanmıştır. Daha sonra MALDI-TOF MS ve gerçek-zamanlı PZR ile aynı sonucu veren suşlar, 16S rRNA sekans analizine gönderilmiş, 1 S. thermophilus, 9 Lb. bulgaricus belirlenmiştir. MALDI-TOF MS ve/veya gerçek-zamanlı PZR ile tanımlanan toplam 61 S. thermophilus ve 21 Lb. bulgaricus suşunun, streptomisin, gentamisin, penisilin G, kloramfenikol, linkomisin, klortetrasiklin, tetrasiklin, ampisilin ve roksitromisin antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları, makro dilüsyon tüp yöntemi ile minimal inhibitör konsantrasyonu (MİK) saptanarak tespit edilmiştir. Analiz sonuçlarına göre, en yüksek duyarlılık S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarının sırasıyla %98.4’ü ve %81’i tespit edilerek ampisiline karşı olduğu bulunmuştur. S. thermophilus suşlarının hepsinin gentamisine, Lb. bulgaricus suşlarının ise streptomisin ve kloramfenikole dirençli olduğu saptanmıştır. Tetrasikline S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarının sırasıyla %26.2’sinin ve %42.9’unun duyarlı olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Üç yöntemle tanımlaması yapılan, 1 S. thermophilus (St27) ve 7 Lb. bulgaricus (Lb25, Lb29, Lb46, ML4-1, ML7-6, ML9-5 ve ML9-6) izolatının doğal bağışıklık sistemine, alerjik yanıta ve immun sistem hücrelerine etkisi araştırılmıştır. THP-1 makrofaj ve K562 (doğal katil hücreler) hücre dizilerinin kullanıldığı çalışmada; seçili LAB ile hücrelerin uyarımı sonrası TNF-α, IL-8 ve IL-10 sitokin yanıtları değerlendirilmiştir. S. thermophilus izolatının, K562 hücre dizisi ile etkileşiminde TNF-α ve IL-8 sitokin düzeyinde artış, THP-1 hücre dizisi ile etkileşiminde ise IL-8 sitokin düzeyinde artış ve IL-10 sitokin düzeyinde azalış tespit edilmiştir. Elde edilen veriler, iki çalışma sonucunun birbiriyle uyumlu olduğunu göstermiştir. Bunun yanı sıra, seçilen LAB izolatlarının her iki hücre tipinde uyardıkları cevapların farklı olduklarını, monositer ve doğal katil hücrelerinde proliferasyonu arttırdıkları belirlenmiştir. Bazı LAB’nin, THP-1 monositer hücre dizilerinde TNF-α sitokin düzeyinde, 2 LAB’si izolatının ise K562 doğal katil hücre dizisinde IL-8 sitokin düzeyinde düşüş tespit edilmiştir. ML7-6 ve ML4-1 izolatlarının THP-1 hücre dizisi ile etkileşiminde ise IL-10 sitokin düzeyinde artışa neden olmuştur. Elde edilen sonuçlar, bu dört izolatın immun sistemi destekleyici etkileri olduğu ve alerjik yanıtı baskıladığını düşündürmüştür