Molecular mechanisms of action of small GTPases in angiogenic responses of endothelial cells: Role of RhoD in the regulation of the cell cycle

The human Rho family of small GTPases represents a major branch of the Ras superfamily, best documented for the regulation of the actin cytoskeleton. In mammalian cells, numerous members of the Rho family have been identified and can be divided into the following groups: Rho (RhoA, B, C), RhoD (RhoD, Rif), Rnd (Rnd1, 2, 3/RhoE), RhoH, RhoBTB (1, 2), Rac (1, 2, 3, RhoG), Cdc42 (Cdc42, TC10/RhoQ, TCL/RhoJ, Wrch1/RhoV, Chp/Wrch2 /RhoU)[Boureux, 2007 #3943]. Small GTPases participate in the regulation of a wide variety of processes such as actin polymerisation, the formation of cellular protrusions, vesicular trafficking, transcriptional regulation, cell motility and cell cycle (reviewed in Etienne-Manneville, 2002 ; Jaffe & Hall, 2005). The most recently evolved member of the Rho family, RhoD, is localized on early endosomes, through which it alters membrane dynamics in the endocytic pathway (Murphy, 1996) and inhibits the motility of endothelial (Murphy, 2001) and 10T1/2 cells (Tsubakimoto, 1999). Moreover, RhoD induces the disassembly of stress fibers and focal adhesions (Murphy, 1996) and may antagonize the effect of RhoA at least on stress fiber formation (Tsubakimoto, 1999). To gain insight into the function of RhoD in vivo, our lab has generated transgenic mice expressing the activated mutant of RhoD, RhoDG26V, in the skin (unpublished results). The mice exhibited epidermal hyperproliferation which clearly implicated RhoD in cell cycle regulation. In the present study, we investigated the role of RhoD during the cell cycle progression, the mechanism involved and the effector through which this regulation occurs. The system we chose to work with was primary endothelial cells as they are well synchronized and can be induced to proliferate with growth factors such as VEGF, furthermore RhoD is also expressed in this cell type. Combined experiments of methyl [³H]-thymidine or 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation and FACS analysis, verified that RhoD affects G1/S transition. Even though myc-RhoDG26V did not enhance cell proliferation, over-expression of the wild-type protein was sufficient to increase the number of cells in S phase, whereas a dominant negative RhoD mutant and RhoD siRNAs inhibited G1/S transition. To ensure that RhoD or mutants do not affect proliferation by inhibiting VEGF induced activation of ERK1/2, the main mitotic cascade of VEGF (Marchall, 1995), we tested the ERK1/2 MAPK phosphorylation upon VEGF administration. In all cases, there was no effect on VEGF-induced phosphorylation of ERK1/2, indicating that RhoD does not affect endothelial cell proliferation by altering the mitogenic signal of VEGF (upstream of ERK1/2), but probably through a direct effect in the regulation of cell cycle progression. During the control of the specificity of the siRNAs against RhoD, we saw indeed that there was no downregulation of the mRNA levels of the related Rho proteins, but interestingly there was an increase in RhoB mRNA. RhoB is a known regulator of cell proliferation (Liu and Prendergast, 2000; Mazieres et al., 2004) and to address whether the effect of RhoD knockdown on cell proliferation was due to its increase in RhoB, we carried out a double knockdown of both RhoD and RhoB and estimated BrdU incorporation. As the double knockdown caused also inhibition of BrdU incorporation, we conclude that the effect of RhoD on cell proliferation is independent of its effect on RhoB. Furthermore, the role of RhoD in cell cycle progression was not mediated through its only known effector, hDia2C. During the course of our experiments, we observed that myc-RhoDG26V caused significant nuclear fragmentation and multi-nucleation. Nuclear fragmentation results from abnormalities during karyokinesis, whereas multi-nucleation stems from inhibition of cytokinesis. Analysis of the activation state of RhoD during the various stages of M phase, indicated an increase of RhoD activation during early steps of mitosis and a decrease towards the exit of M. The punctate (endosomal) localization of RhoDWT/G26V did not change during mitosis, and again hDia2C did not mediate the effects of RhoD in M phase. Therefore with regard to cyctokinesis defects we suspect that a continued activation of RhoD at a phase of mitosis where the protein is not normally active causes mislocalization of myosin 2 and cytokinesis defects. With respect to nuclear fragmentation the mechanism of action of RhoD is unclear however we observed that RhoD localizes to the peri-centrosomal area and perhaps may play a role in centrosome duplication and/or maturation – this requires further investigation. As the known effector of RhoD did not mediate the cell cycle effects described above, we set out to identify RhoD-interacting proteins playing a role in S and/or M phase regulation, and used the yeast two-hybrid system. We identified Diaphanous 1 as a novel RhoD effector and validated the interaction using a series of independent biochemical and microscopic approaches. Our results indicate that this molecule is indeed the mediator of RhoD during the regulation of the cell cycle progression, which is consistent with established data regarding the role of Diaphanous 1 in the above process. In conclusion, our study indicates that the cycling of RhoD, between the inactive GDP and active GTP forms, requires a strict regulation for proper progression of the cell cycle. The effect of RhoD in the progression of the cell cycle seems to be mediated by a novel effector, Diaphanous 1.Οι πρωτεΐνες της οικογένειας των μικρών GTPασών Rho συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση του κυτταρικού σκελετού και η ρύθμιση αυτή εξαρτάται από τη μετατροπή των μορίων αυτών από την ανενεργή GDP μορφή τους, στην ενεργή GTP κατάσταση. Οι Rho GTPάσες συμβάλλουν στην εξέλιξη του κύκλου, από τις μεταβάσεις των φάσεων G1/S και G2/M, έως την ολοκλήρωση της μιτωτικής διαίρεσης (Jaffe and Hall, 2005). Τα πιο μελετημένα μέλη της οικογένειας είναι οι Rho A, B και C και η λειτουργική τους δράση επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης με καθοδικούς, στο μοριακό τους μονοπάτι, τελεστές. Η RhoD, αποτελεί ένα από τα πιο πρόσφατα, στην εξέλιξη, μέλη της οικογένειας. Η λειτουργία της έχει σχετισθεί με την ομοτυπική σύντηξη των πρώιμων ενδοσωμάτων (Murphy et al., 1996), την κυτταρική μετανάστευση (Tsubakimoto et al., 1999), (Murphy et al., 2001). (Nguyen et al., 2002), τη σταθεροποίηση του νευρικού κώνου (Zanata et al., 2002) (Negishi, 2007), αλλά και την κυτταροκίνηση (Tsubakimoto et al., 1999). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση της πρωτεΐνης RhoD στην εξέλιξη του κύκλου ζωής του κυττάρου. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την ύπαρξη μηχανισμού δράσης της RhoD κατά τη μετάβαση G1/S και ολοκλήρωση της M φάσης του κυτταρικού κύκλου, μέσω αλληλεπίδρασης με έναν καινούριο τελεστή, την πρωτεΐνη Diaphanous 1 (Diaph1/mDia1). Η RhoD συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (G1/S): Το ερέθισμα για να ασχοληθούμε με το θέμα αυτό, ήταν η παρατηρούμενη υπερπλασία στην επιδερμίδα διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν myc-RhoDG26V. Αρχικά θελήσαμε να επιβεβαιώσουμε την παρατηρούμενη επίδραση της RhoD στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σε συνθήκες καλλιέργειας. Το βασικό σύστημα μελέτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν τα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς οι αποκρίσεις τους επηρεάζουν άμεσα την αγγειογενετική διαδικασία και η θεματολογία αυτή ενδιαφέρει άμεσα το εργαστήριό μας. Συνδυασμένα πειράματα ενσωμάτωσης μεθυλο-θυμιδίνης, βρωμο-δεόξυ-ουρυδίνης και κυττταρομετρίας ροής έδειξαν ότι πράγματι η RhoD συμμετέχει στη μετάβαση G1/S. Αν και για αδιευκρίνιστους λόγους η myc-RhoDG26V δεν ενίσχυσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, η έκφραση της myc-RhoDWT ήταν αρκετή να αυξήσει τον πληθυσμό που ολοκλήρωσε την S φάση, ενώ η απενεργοποίηση της πρωτεΐνης/αποσιώπηση του γονιδίου οδήγησε σε αναστολή της G1/S μετάβασης. Στα πλαίσια ελέγχου της ειδικότητας που παρουσιάζουν τα siRNA ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν έναντι της RhoD, παρατηρήσαμε ότι ναι μεν είναι ειδικά, καθώς δε μειορυθμίζουν τα mRNA επίπεδα των συγγενικών Rho, ωστόσο οδηγούν στη μεταγραφική ενεργοποίηση της RhoB. Η αυξημένη όμως έκφραση της RhoB, έχει συσχετισθεί με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού(Liu and Prendergast, 2000; Mazieres et al., 2004). Πειράματα ταυτόχρονης αποσιώπησης των γονιδίων RhoD/RhoB έδειξαν πως παρά την αναστολή της μεταγραφικής ενεργοποίησης της RhoB, η αποσιώπηση της RhoD εξακολουθεί να επιδρά αρνητικά στη φάση S, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εν συνεχεία, θελήσαμε να ελέγξουμε την πιθανότητα η επίδραση της RhoD στον VEGF-επαγόμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό να οφείλεται σε αναστολή της μετάδοσης του σήματος VEGF στο μιτωτικό του μονοπάτι (ERK1/2). Τα φυσιολογικά επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERK1/2 από τoν VEGF καταδεικνύουν πως ο συγκεκριμένος ρόλος της RhoD δεν οφείλεται σε παρεμβολή μετάδοσης του σήματος VEGF, αλλά πιθανότερα σε άμεση ρύθμιση των μηχανισμών ελέγχου και εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε πως η δράση αυτή της RhoD δε φαίνεται να διαμεσολαβείται από το, μόνο μέχρι στιγμής, γνωστό τελεστή hDia2C. Η RhoD συμμετέχει στην κυτταρική διαίρεση: Η συσχέτιση της λειτουργίας με τη Μ φάση, προέκυψε όταν κατά την διαδικασία των πειραμάτων διαπιστώσαμε ότι η μόνιμα ενεργή myc-RhoDG26V προκαλεί φαινόμενα πυρηνικού κατακερματισμού και πολυπυρήνωσης. Ο πυρηνικός κατακερματισμός είναι αποτέλεσμα παρεμβολών κατά τη διάρκεια της καρυοκίνησης, ενώ η πολυπυρήνωση προκύπτει από αναστολή της κυτταροκίνησης. Η myc-RhoDG26V φαίνεται να επηρεάζει φαινόμενα σημαντικά για την πυρηνική και κυτταροπλασματική διαίρεση, όπως τη σύσταση κέντρου οργάνωσης μικροσωληνίσκων (πολλαπλά ή διαρρηγμένα κεντροσωμάτια) και τον προσανατολισμό της μυοσίνης 2. Ανάλυση της ενεργότητας της RhoD έδειξε ότι η πρωτεΐνη ενεργοποιείται στα πρώτα στάδια της φάσης Μ και απενεργοποιείται κατά την έξοδο από τη φάση αυτή. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός δείχνει ότι η δράση της ασκείται από τα ενδοσώματα τόσο σε μεσοφασικά όσο και μιτωτικά κύτταρα, ενώ και πάλι η hDia2C δε φαίνεται να διαμεσολαβεί τη δράση. Η Diaphanous 1 διαμεσολαβεί τη δράση της RhoD στην εξέλιξη του κύκλου: Η περιορισμένη συμμετοχή της hDia2C σε αυτές τις επιδράσεις της RhoD μας οδήγησε στην ανίχνευση νέου τελεστή της RhoD. Για το λόγο προχωρήσαμε στην τεχνική σάρωσης διπλού υβριδίου, από την οποία ταυτοποιήσαμε έναν καινούριο τελεστή, την πρωτεΐνη Diaphanous1. H πρωτεΐνη αυτή αποδείχθηκε με ανεξάρτητα βιοχημικά και μικροσκοπιακά πειράματα ότι αποτελεί πραγματικό τελεστή της RhoD και το συνδετικό κρίκο των επιπτώσεων της RhoD στη μετάβαση G1/S. Τα αποτελέσματά μας ενισχύονται από βιβλιογραφικές αναφορές που συνδέουν τη λειτουργία της Diaphanous1 με τις φάσεις αυτές. Ολοκληρώνοντας, η μελέτη μας υποδεικνύει ότι ο κύκλος ενεργοποίησης της RhoD χρειάζεται αυστηρή ρύθμιση, για τη διεξαγωγή ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και η δράση αυτή φαίνεται ότι διαμεσολαβείται από ένα νέο τελεστή, τη Diaphanous 1