Molecular analysis of insecticide resistance mechanisms and biotechnological approaches for novel selective compound development

Insect/mite pests are defined as insects and mites that can have serious impact on agricultural crops, livestock/poultry and public health. One of the control measures is the use of insecticides. Nevertheless, the improper or excess insecticide application in the field has led to the development of resistance. The analysis of resistance mechanisms is a necessary condition for the management of the resistance phenomenon, providing important information in the effort to discover new insecticides or even new insecticide targets.In the first chapter, the resistance mechanisms of the poultry red mite (Dermanyssus gallinae) (Poultry Red Mite-PRM) were studied in populations from Greece and Europe, with an emphasis on pyrethroid insecticides and Amitraz. High levels of resistance to pyrethroids and Amitraz were detected in populations (GRC1, GRC2) collected from Megara and Ilion (Greece), respectively, areas that bear almost 40% of the country's chicken farming. Resistance to the pyrethroids -cypermethrin, cyfluthrin and fluvalinate, acaricides that have been used extensively in Greece for several years, were found 10,000 times more compared to a sensitive laboratory strain. The presence and frequency of pyrethroid resistance mutations (which have been identified and characterized in other species) were then assessed in a large number of poultry red mite populations across Europe (53 samples in total from 15 European countries). The results showed that the mutations M918L/T, L925V, T929I, F1534L, F1538L/I, F1537L were widespread throughout Europe, as only three of the 53 samples tested had no mutation in the voltage gated sodium channel regions (target of pyrethroids (VGSC (IIS4 -S5 and IIIS6)), investigated in this study. At the same time, the GRC1 population was found to be particularly resistant to Amitraz (RR>740,000) and during the analysis of the β-adrenergic receptor, the target of Amitraz, a new mutation (A89V) was found (also was identified in three of the 11 European countries examined). The mutation was analyzed for its potential role in resistance by heterologous expression in the Xenopus system, without conclusive results. To further analyze the mechanisms of resistance in poultry red mite, a transcriptome analysis was performed and we aimed to analyze 3 overexpressed P450s, to investigate their potential role in the multiresistance phenotype. After the heterologous expression of functional 59/ CYP4PG-like, 97/ CYP3012A-like, 51/ CYP3110A-like in E. coli cells, their activity against substrates (fluorescent) and insecticides (pyrethroids and Amitraz) was analyzed and it was shown that only 51 / CYP3110A-like showed activity against 7-ethoxycoumarin, EC, MC, EMC, BOMCC and EOMCC.In the second chapter, the possible resistance mechanisms of Lobesia botrana populations collected from Greece and Turkey were studied molecularly (for the first time in the literature). Greek populations showed low resistance (2-5 times) to the studied insecticides (chlorantraniliprole, alpha-cypermethrin, spinetoram, etofenprox, acetamiprid) while Turkish populations showed moderate resistance (4 and 30-fold for indoxacarb, 5-59 times for spinosad and 18-30 times for deltamethrin). Insecticide targets were investigated for possible mutations in the L. botrana populations (compared to a susceptible laboratory strain), by sequencing the relevant gene segments. For all genes studied, no known and/or novel mutations were detected in any of the gene targets of pyrethroids, oxadiazines (VGSC), spinosyns (nAChR_α6), diamides (RyR), avermectins (GluCl) and organophosphates (ace). Nevertheless, through this study, a set of gene sequences and a transcriptome were generated, that will help in subsequent studies in the analysis of possible target resistance mechanisms in L. botrana. The transcriptome also yielded cytochrome P450 genes that were phylogenetically analyzed to help the scientific community study the role of detoxification (metabolism) in insecticide resistance in the future.The third chapter of the study summarizes the literature related to cytochrome P450s from insects (pests and beneficial) and mites that have been functionally validated for their role in xenobiotic detoxification by in vitro or in vivo techniques. The phylogenetic correlations, the systems used to analyze the role of each enzyme are presented and the respective limitations are discussed. The above summary is under the umbrella of the possible involvement of P450s in the development of selective insecticides, as P450s catalyze the detoxification of many active substances in pollinators and beneficial insects, ultimately being the key to insecticide selectivity.In the fourth chapter, a functional analysis of the GGPPS protein from Lepidoptera was carried out as well as its characterization as a potential target for insecticides. Partial deletion of the GGPPS gene using the CRISPR genetic modification technique in the lepidopteran Spodoptera frugiperda indicated the necessity of this gene for insect development. Furthermore, it was shown that the GGPPS protein is expressed and functional in the E.coli heterologous expression system, and that its activity can be inhibited by bisphosphonates inhibitors, findings which highlight its role as a potential insecticide target in the future. For the above, a screening protocol was developed which could contribute to the discovery of novel insecticides in the future.Ως έντομα/ ακάρεα εχθροί ορίζονται τα έντομα και ακάρεα που προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στις αγροτικές καλλιέργειες, την κτηνοτροφία/πτηνοτροφία και στη δημόσια υγεία. Ο έλεγχος τους πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο με χρήση εντομοκτόνων. Παρόλα αυτά η λανθασμένη ή και αλόγιστη εφαρμογή τους στο πεδίο έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Η ανάλυση των μηχανισμών ανθεκτικότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη διαχείριση και την αντιμετώπιση του φαινομένου, παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες στην προσπάθεια ανακάλυψης νέων εντομοκτόνων ή και νέων στόχων εντομοκτόνων.Στο πρώτο κεφάλαιο μελετήθηκαν οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας του ερυθρού ακάρεως των πουλερικών (Dermanyssus gallinae) (Poultry Red Mite- PRM) σε πληθυσμούς από την Ελλάδα και την Ευρώπη, με έμφαση στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα και το Amitraz. Υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή και το Amitraz εντοπίστηκαν σε πληθυσμούς (GRC1, GRC2) που συλλέχθηκαν από τα Μέγαρα και το Ίλιον (Ελλάδα), αντίστοιχα, όπου φιλοξενείται σχεδόν το 40% της εκτροφής ορνίθων της χώρας. Παρατηρήθηκε η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή -cypermethrin, cyfluthrin και fluvalinate, ακαρεοκτόνα που χρησιμοποιούνται εκτενώς στην Ελλάδα εδώ και αρκετά χρόνια. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε 10.000 φορές περισσότερη συγκέντρωση ακαρεοκτόνου στα ανθεκτικά στελέχη, σε αντίθεση με ευαίσθητο εργαστηριακό στέλεχος ,για την θανάτωση του 50% του πληθυσμού των ακάρεων . Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η παρουσία και η συχνότητα μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή (οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί σε άλλα είδη), σε μεγάλο αριθμό πληθυσμών ερυθρού ακάρεως των πουλερικών σε όλη την Ευρώπη (53 δείγματα συνολικά από 15 ευρωπαϊκές χώρες). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μεταλλαγές M918L/Τ, L925V, T929I, F1534L, F1538L/Ι, F1537L ήταν ευρέως διαδεδομένες σε όλη την Ευρώπη, καθώς μόνο τρία από τα 53 δείγματα που εξετάστηκαν δεν είχαν καμία μεταλλαγή στις περιοχές του τασο- εξαρτώμενου καναλιού νατρίου, στόχου των πυρεθροειδών (VGSC (IIS4 -S5 και IIIS6)) που διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Παράλληλα, ο πληθυσμός GRC1 βρέθηκε ιδιαίτερα ανθεκτικός στο Amitraz (RR>740.000) και κατά την ανάλυση του β αδρενεργικού υποδοχέα, στόχου του Amitraz, βρέθηκε μια νέα μεταλλαγή (Α89V) η οποία εντοπίστηκε και στους τρεις από τους πληθυσμούς 11 Ευρωπαϊκών χωρών που εξετάστηκαν. Η μεταλλαγή αναλύθηκε για τον πιθανό ρόλο της στην ανθεκτικότητα με ετερόλογη έκφραση στο σύστημα Xenopus, χωρίς καταληκτικό συμπέρασμα. Για την περαιτέρω ανάλυση των μηχανισμών ανθεκτικότητας στο ερυθρό άκαρι των πουλερικών, έγινε ανάλυση μεταγραφώματος και στοχεύσαμε στην ανάλυση 3 υπερεκφρασμένων P450s, για τη διερεύνηση του πιθανού ρόλου τους στο φαινότυπο πολυανθεκτικότητας. Μετά την ετερόλογη έκφραση των λειτουργικών 59/ CYP4PG-like, 97/ CYP3012A-like, 51/ CYP3110A-like σε κύτταρα E. coli αναλύθηκε η ενεργότητά τους έναντι υποστρωμάτων (φθοριζόντων) και εντομοκτόνων (πυρεθροειδή και Amitraz) και δείχθηκε πως μόνο η 51/ CYP3110A-like έδειξε ενεργότητα έναντι των 7-ethoxycoumarin, EC, MC, EMC, BOMCC και EOMCC.Στο δεύτερο κεφάλαιο μελετήθηκαν μοριακά (για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία) οι πιθανοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας πληθυσμών ευδεμίδας (Lobesia botrana) που συλλέχθηκαν από Ελλάδα και Τουρκία. Οι Ελληνικοί πληθυσμοί είχαν χαμηλή ανθεκτικότητα (2-5 φορές) στα μελετώμενα εντομοκτόνα (chlorantraniliprole, alpha-cypermethrin, spinetoram, etofenprox, acetamiprid) ενώ οι Τουρκικοί είχαν μέτρια ανθεκτικότητα (4 και 30-φορές για το indoxacarb, 5-59 φορές για το spinosad και 18-30 φορές για το deltamethrin). Διερευνήθηκαν στόχοι εντομοκτόνων για πιθανές μεταλλαγές στους πληθυσμούς ευδεμίδας (σε σύγκριση με ένα ευαίσθητο εργαστηριακό στέλεχος), με αλληλούχιση των σχετικών γονιδιακών τμημάτων. Για όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν, δεν ανιχνεύθηκαν γνωστές ή/και νέες μεταλλαγές σε κανέναν από τους γονιδιακούς στόχους των πυρεθροειδών, οξαδιαζινών (VGSC), σπινοσυνών (nAChR_α6), διαμιδίων (RyR), αβερμεκτινών (GluCl) και οργανοφωσφορικών (ace). Παρόλα αυτά, μέσα από τη μελέτη αυτή, δημιουργήθηκε ένα σύνολο αλληλουχιών γονιδίων, καθώς και ένα μεταγράφωμα που θα βοηθήσουν σε επόμενες μελέτες στην ανάλυση πιθανών μηχανισμών ανθεκτικότητας στόχου στην ευδεμίδα. Από το μεταγράφωμα επίσης προέκυψαν γονίδια του κυτοχρώματος P450 που αναλύθηκαν φυλογενετικά για να βοηθήσουν την επιστημονική κοινότητα να μελετήσει το ρόλο της αποτοξικοποίησης (μεταβολισμός) στην ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα.Στο τρίτο κεφάλαιο της μελέτης συνοψίζεται η βιβλιογραφία που σχετίζεται με τα κυτοχρώματα P450s από έντομα (επιβλαβή και ωφέλιμα) και ακάρεα που έχουν συσχετιστεί λειτουργικά με την αποτοξικοποίηση ξενοβιοτικών με in vitro ή in vivo τεχνικές. Η φυλογενετικοί συσχετισμοί, τα συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση του ρόλου του κάθε ενζύμου παρουσιάζονται και συζητούνται οι εκάστοτε περιορισμοί. Η παραπάνω σύνοψη γίνεται στο πλαίσιο της πιθανής συμμετοχής των P450s στην ανάπτυξη εκλεκτικών εντομοκτόνων, καθώς τα P450s καταλύουν την αποτοξικοποίηση πολλών δραστικών ουσιών στους επικονιαστές και τα ωφέλιμα έντομα, αποτελώντας τελικά το κλειδί για την εκλεκτικότητα του εντομοκτόνου. Στο τέταρτο κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης GGPPS από Λεπιδόπτερα καθώς και χαρακτηρισμός της ως πιθανού στόχου για εντομοκτόνα. Μερική απαλοιφή του γονιδίου GGPPS με τη χρήση της τεχνικής γενετικής τροποποίησης CRISPR στο λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda υπέδειξε την αναγκαιότητα του γονιδίου αυτού για την ανάπτυξη των εντόμων. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη GGPPS εκφράζεται και είναι λειτουργική στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Escherechia.coli, και ότι η δράση της μπορεί να ανασταλεί από διφωσφονικούς αναστολείς, ευρήματα τα οποία αναδεικνύουν το ρόλο της μελλοντικά ως πιθανό στόχο εντομοκτόνων. Για τα παραπάνω, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο διαλογής το οποίο θα μπορούσε μελλοντικά να συμβάλει στην ανακάλυψη νέων εντομοκτόνω